Оценка эффективности анализа с использованием стандартных кривых
Эффективность, воспроизводимость и динамический диапазон анализа SYBR Green I могут быть
определяется путем построения стандартной кривой с использованием серийных разведений известного
шаблон, как описано в разделе 1.1.3. Эффективность анализа должна быть
90–105%, R 2 стандартной кривой должен быть> 0,980 или r> | –0,990 |, а
C T значения повторов должны быть одинаковыми.
Важно отметить, что диапазон концентраций матрицы, используемых для
стандартная кривая должна охватывать весь диапазон концентраций матрицы
тестовые образцы, чтобы показать, что результаты тестовых образцов находятся в пределах линейного
динамический диапазон анализа. Если тестовые образцы дают результаты за пределами диапазона
Для стандартных кривых должно быть выполнено одно из следующих действий:
• Построить более широкую стандартную кривую, охватывающую концентрации тестируемого образца и
выполнить анализ, чтобы убедиться, что анализ является линейным в этом новом диапазоне
• Если испытуемые образцы дают более низкую C T, чем самая высокая концентрация стандартов
использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя разведенные образцы
• Если испытуемые образцы дают более высокий C T, чем самая низкая концентрация стандартов
использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя большее количество
тестовые образцы
Рис. 2.13. Анализ кривой плавления. Наличие неспецифического продукта, в данном случае праймеров-димеров,
|
|
|
проявляется как дополнительный пик в анализе кривой плавления. А. Отрицательная первая производная от изменения
Флуоресценция представлена в зависимости от температуры. Б. Гель-анализ продуктов КПЦР. Полоса 1,
AmpliSize молекулярная линейка 50–2000 п.н .; дорожки 2 и 3, два повтора из реакции, показанной на (А).
A
В
| Страница 27 |
начиная
разработка и оптимизация реакций зонда TaqMan
2.4 Разработка и оптимизация TaqMan
Зонд Реакции
В анализе TaqMan используется пара ПЦР-праймеров и двойная метка, специфичная для мишени.
флуоресцентный зонд. Шаги для разработки анализа TaqMan:
• Конструкция праймера и зонда
• Проверка достоверности и оптимизация
В разделах 2.4.1 и 2.4.2 приведены рекомендации по выполнению этих двух шагов.
Дизайн грунтовки и зонда
Как и в случае любой реакции КПЦР, анализы на основе TaqMan требуют эффективных и специфических анализов.
амплификация продукта. Правила оформления грунтовки аналогичны описанным в
Раздел 2.3.1. Как правило, грунтовки рассчитаны на температуру отжига
между 55 и 60ºC. Мы рекомендуем использовать программное обеспечение, такое как Beacon Designer
для разработки ваших праймеров TaqMan и зонда TaqMan. Потому что двойная метка
|
|
|
зонд является наиболее дорогостоящим компонентом анализа TaqMan, мы предлагаем вам заказать
два праймера и проверить их эффективность с помощью SYBR Green I перед заказом
зонд с двойной меткой. См. Раздел 2.3 для получения подробной информации о том, как проверить набор праймеров.
в реакции SYBR Green I.
Зонд TaqMan должен иметь Т м 5-10 ° С выше , чем у праймеров.
В большинстве случаев зонд должен быть <30 нуклеотидов и не должен содержать G в
его 5 'конец, потому что это может погасить флуоресцентный сигнал даже после гидролиза.
Выберите последовательность в пределах цели, которая имеет содержание GC 30–80%, и
проектировать зонд для отжига на нити, которая имеет больше Gs, чем Cs (поэтому зонд
содержит больше C, чем Gs).
Важным аспектом разработки зонда TaqMan является репортер и гаситель
выбор. Список часто используемых комбинаций репортеров и гасителей
показано в таблице 2.1. Мы рекомендуем использовать FAM-маркированные зонды при разработке
одноплексные реакции, потому что они недороги и легко доступны, выполняют
хорошо, и может быть обнаружен всеми инструментами, в настоящее время на рынке.
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
|
|
|
23
| Страница 28 |
начиная
разработка и оптимизация реакций зонда TaqMan
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
24
Другим важным соображением для получения точных данных КПЦР в реальном времени является
зонд качества. Даже идеально разработанный зонд может выйти из строя, если зонд неправильно
синтезированный или очищенный. Неправильное удаление несвязанной флуоресцентной метки, неэффективно
связывание и / или плохое гашение могут давать высокий флуоресцентный фон или
шум. Низкое отношение сигнал / шум приводит к снижению чувствительности и уменьшению
линейный динамический диапазон. Два зонда с одинаковыми последовательностями и идентичными
флуорофорные метки могут быть заметно различны при синтезе различными
поставщики или даже в разное время одним и тем же поставщиком. Мы рекомендуем сохранить
аликвоты каждого зонда для прямых сравнений с вновь синтезированными зондами.
Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 103; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!