Что такое ПЦР в реальном времени?
ПЦР в реальном времени
Руководство по применению
| Страница 2 |
содержание
оглавление я
Содержание
Обзор ПЦР в реальном времени
2
1.1 Ключевые понятия ПЦР в реальном времени
2
1.1.1 Что такое ПЦР в реальном времени?
2
1.1.2 Как работает ПЦР в реальном времени
3
1.1.3 Отличительные признаки оптимизированного анализа КПЦР
4
Начало работы
8
2.1 Общие соображения
8
2.2 Экспериментальные соображения по проектированию КПЦР
9
2.2.1 Singleplex или Multiplex?
9
2.2.2 Выбор химии
9
2.2.2.1 ДНК-связывающие красители (SYBR Green I)
10
2.2.2.2 Флуоресцентная химия на основе праймеров и зондов
12
2.3 Разработка и оптимизация реакций SYBR Green I
19
2.3.1. Проектирование праймеров и ампликонов
19
2.3.2 Проверка достоверности и оптимизация
20
2.3.2.1 Оптимизация температуры отжига
20
2.3.2.2 Оценка эффективности анализа с использованием стандартных кривых
22
2.4. Разработка и оптимизация зондовых реакций TaqMan.
23
2.4.1 Дизайн грунтовки и зонда
23
2.4.2 Проверка достоверности и оптимизация
24
Вопросы мультиплексирования
28
3.1 Учебник для начинающих и зондов для мультиплексирования
28
3.2 Выбор репортеров и гасителей для мультиплексирования
29
3.3 Оптимизация индивидуальных анализов перед мультиплексированием
29
3.4 Валидация мультиплексных анализов
29
3.5 Оптимизация мультиплексных анализов
30
| Страница 3 |
содержание
оглавление ii
Анализ данных КПЦР в реальном времени
|
|
|
34
4.1 Абсолютная количественная оценка
35
4.1.1. Когда следует использовать абсолютное количественное определение?
35
4.1.2 Абсолютное количественное определение с использованием стандартной кривой
35
4.2 Относительная количественная оценка
37
4.2.1 Когда следует использовать относительную количественную оценку?
37
4.2.2 Относительная количественная оценка, нормализованная по отношению к единице массы
38
4.2.3 Относительная количественная оценка, нормализованная к эталонному гену
40
4.2.3.1 2 –AAC
Метод Т (Ливак)
41
4.2.3.2 Метод AC T с использованием эталонного гена
42
4.2.3.3 Метод Пфаффля
43
Анализ экспрессии генов
46
5.1 Экспериментальный дизайн
46
5.2 Изоляция РНК
47
5.2.1 Сбор образцов
47
5.2.2 Экстракция РНК
48
5.2.3 Анализ количества и качества нуклеиновой кислоты
48
5.3 Подготовка матрицы кДНК (обратная транскрипция)
49
5.4 Разработка анализа КПЦР
50
5.5 Эксперименты
51
5.5.1 Реакционные компоненты для мультиплексного анализа
51
5.5.2 Протокол езды на велосипеде
51
5.6 Анализ данных генной экспрессии
52
Генотипирование / аллельная дискриминация
54
6.1 Экспериментальный дизайн
55
6.2 Разработка грунтовки и зонда с использованием зондов TaqMan
56
6.3 Экстракция ДНК и подготовка образца
|
|
|
57
6.4 Компоненты реакции при использовании зондов TaqMan
58
6.5 Оптимизация
59
6.6 Протокол езды на велосипеде с использованием TaqMan Probes
59
6.7 Анализ данных аллельной дискриминации
59
6.7.1 Проверка достоверности анализа аллельной дискриминации
59
6.7.2 Присвоение генотипа
72
| Страница 4 |
Обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО)
76
7.1 Экспериментальный дизайн
77
7.2 Экстракция ДНК и подготовка образца для обнаружения ГМО
77
7.3. Обнаружение ГМ-сои с использованием однократного анализа SYBR Green I qPCR
78
7.3.1 Компоненты реакции
78
7.3.2 Протокол езды на велосипеде
79
7.3.3 Анализ данных
79
7.4 Обнаружение ГМ-сои с использованием мультиплексного анализа TaqMan qPCR
81
7.4.1 Компоненты реакции
82
7.4.2 Протокол езды на велосипеде
82
7.4.3 Анализ данных
82
Руководство по продукту
85
содержание
оглавление iii
| Страница 5 |
Обзор
ПЦР в реальном времени
Ключевые понятия ПЦР в реальном времени
2
Что такое ПЦР в реальном времени?
2
Как работает ПЦР в реальном времени
3
Отличительные признаки оптимизированного анализа КПЦР
4
| Страница 6 |
обзор ПЦР в реальном времени
ключевые концепции ПЦР в реальном времени
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
|
|
|
2
1. Обзор
ПЦР в реальном времени
Амплификация и обнаружение нуклеиновых кислот являются одними из наиболее ценных методов.
используется в биологических исследованиях сегодня. Ученые во всех областях исследований - основные
наука, биотехнология, медицина, криминалистика, диагностика и многое другое -
полагаться на эти методы для широкого спектра применений. Для некоторых приложений
качественного обнаружения нуклеиновых кислот достаточно. Другие приложения, однако, требуют
количественный анализ. Выбор лучшего метода для вашего приложения требует
широкие знания доступных технологий.
Это руководство представляет собой введение во многие технические аспекты реального времени.
ПЦР. Он содержит рекомендации по разработке лучшего анализа ПЦР в реальном времени для вашего
экспериментирует и объясняет, как данные ПЦР в реальном времени используются в различных приложениях.
В разделах 5–7 мы представляем примеры протоколов и данных, которые демонстрируют использование
ПЦР в реальном времени в конкретных приложениях, а именно: анализ экспрессии генов, аллель
дискриминация и обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО).
|
|
|
Мы надеемся, что это руководство предоставит вам информацию, необходимую для
мощная техника для вашей скамейки - и не только.
1.1 Ключевые понятия ПЦР в реальном времени
Что такое ПЦР в реальном времени?
В обычной ПЦР амплифицированный продукт или ампликон детектируется
анализ конечной точки, путем запуска ДНК на агарозном геле после того, как реакция имеет
законченный. Напротив, ПЦР в реальном времени позволяет накоплению амплифицированного продукта
быть обнаруженным и измеренным в ходе реакции, то есть в «реальном времени».
Обнаружение продуктов ПЦР в реальном времени стало возможным благодаря включению в реакцию
флуоресцентная молекула, которая сообщает об увеличении количества ДНК с
пропорциональное увеличение флуоресцентного сигнала. Используемые флуоресцентные химикаты
для этой цели включают ДНК-связывающие красители и флуоресцентно-меченные последовательности-
специфические праймеры или зонды. Специализированные термоциклы, оснащенные флуоресценцией
модули обнаружения используются для контроля флуоресценции при усилении.
Измеренная флуоресценция отражает количество амплифицированного продукта в каждом цикле.
| Страница 7 |
обзор ПЦР в реальном времени
ключевые концепции ПЦР в реальном времени
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
3
цикл
Экспоненциальная фаза
Значение C T
не-
экспоненциальный
плато
фаза
0
10
20
30
40
Основным преимуществом ПЦР в реальном времени по сравнению с обычной ПЦР является то, что ПЦР в реальном времени
позволяет точно определить начальный номер копии шаблона и
высокая чувствительность в широком динамическом диапазоне. Результаты ПЦР в реальном времени могут быть
качественный (наличие или отсутствие последовательности) или количественный (количество копий
ДНК). Количественная ПЦР в реальном времени также известна как КПЦР. Напротив,
обычная ПЦР в лучшем случае полуколичественная. Кроме того, данные ПЦР в реальном времени могут
оценивать без гель-электрофореза, что приводит к сокращению времени эксперимента и
увеличенная пропускная способность. Наконец, потому что реакции запускаются и данные оцениваются в
система с закрытыми трубами, возможность загрязнения уменьшается, и необходимость
для постамплификации манипуляция исключена.
Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 130; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!