Относительная количественная оценка, нормализованная по отношению к
Единица массы
Преимущества использования единичной массы (например, количества клеток или мкг нуклеиновой кислоты)
а не эталонный ген в качестве нормализатора в том, что экспериментальный дизайн
концептуально прост, а математическая обработка проста.
Метод требует точного количественного определения исходного материала, независимо от
ли количество клеток или мкг нуклеиновой кислоты используется в качестве нормализатора.
При сравнении нескольких образцов с использованием относительного количественного анализа, один образец
обычно выбирается в качестве калибратора (иногда его называют контрольным образцом),
и экспрессия целевого гена во всех других образцах выражается как
увеличить или уменьшить относительно калибратора. Обычно, необработанные или
Исходный образец выбран в качестве калибратора. В случае примера p53,
мы можем выбрать нормальные клетки яичников в качестве калибратора и раковых
клетки яичников в качестве тестового образца.
Страница 43 |
анализ данных КПЦР в реальном времени
относительная количественная оценка
Определить относительную экспрессию р53 в раковых и нормальных яичниках
клетки, общую РНК готовили из равного количества нормальных клеток яичника и
раковые клетки яичников. Значения C T для тестируемого образца (раковые клетки) и
Образец калибратора (нормальные клетки) затем использовали для расчета соотношения между
|
|
два по следующему уравнению:
Соотношение (тест / калибратор) = E C T (калибратор) - C T (тест)
E - эффективность реакции и может быть определена, как описано в разделе
1.1.3. Если мы предположим, что анализ имеет идеальную эффективность амплификации (то есть
шаблон удваивается в каждом цикле амплификации), тогда уравнение выше становится:
Соотношение (тест / калибратор) = 2 C T (калибратор) - C T (тест)
или
Соотношение (тест / калибратор) = 2 ∆C T
где ΔC T = C T (калибратор) - C T (испытание)
Этот метод для вычисления относительного выражения часто называют ΔC T
метод. Ниже приведен гипотетический пример, демонстрирующий, как ΔC T
Метод может быть использован для определения относительной экспрессии целевого гена (р53) в
раковые и нормальные клетки яичников.
Пример : кДНК, представляющая 50 нг общей РНК, выделенной как из нормальной, так и из
клетки опухоли яичника анализировали на предмет сообщения р53. Значения C T для каждого образца
показаны ниже:
Образец
C T для р53 (цель)
Нормальный (калибратор)
15,0
Опухоль (тест)
12,0
Предполагая 100% эффективность амплификации (E = 2), и выбирая нормальные клетки в качестве
калибратор, относительная экспрессия экспрессии р53 в раковых и нормальных
|
|
Клетки яичника рассчитывается следующим образом:
Соотношение (тест / калибратор) = 2 C T (калибратор) - C T (тест)
= 2 (15 - 12)
= 8
Следовательно, экспрессия р53 в опухолевых клетках в 8 раз выше, чем в норме.
клетки яичников.
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени
39
Страница 44 |
анализ данных КПЦР в реальном времени
относительная количественная оценка
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени
40
Относительная количественная оценка, нормализованная к
Эталонный ген
Преимущество использования эталонного гена (такого как GAPDH, β-актин и др.) Скорее
чем единица массы в качестве нормализатора является то, что этот метод обходит необходимость
точное количественное определение и загрузка исходного материала. Это особенно
удобно при проведении экспериментов по относительной экспрессии генов, когда
материал часто ограничен. Недостатком является то, что этот метод требует
наличие известного эталонного гена или генов с постоянной экспрессией во всех
образцы проверены и чья экспрессия не изменяется при обработке
исследование. Идентификация такого эталонного гена не тривиальна, и в последнее время
|
|
Было предложено, что в большинстве случаев использование нескольких эталонных генов может
необходим для точного количественного определения (см. Vandesompele et al., Genome Biology 3,
исследование 0034.1–0034.11, 2002, для подробного обсуждения).
Как обсуждалось в предыдущем разделе, при сравнении нескольких образцов
относительное количественное определение, один из образцов обычно выбирается в качестве калибратора,
и экспрессия гена - мишени во всех других образцах является выражено как
увеличить или уменьшить относительно калибратора. Обычно, необработанные или
Исходный образец выбран в качестве калибратора. В случае примера p53,
мы можем выбрать нормальные клетки яичников в качестве калибратора и раковых
клетки яичников в качестве тестового образца. Определить относительное выражение цели
ген в тестовом образце и образце калибратора, используя эталонный ген (ы) в качестве
нормализатор, уровни экспрессии как целевого, так и эталонного генов необходимы
определяется с помощью RT-КПЦР. Короче говоря, вам нужно определить значения C T ,
как показано в таблице 4.2.
Таблица 4.2. Значения C T, необходимые для относительного количественного определения с эталонным геном
|
|
как нормализатор.
Тестовое задание
Калибратор (кал)
Целевой ген
C T (цель, тест)
C T (цель, кал)
Эталонный ген
C T (ссылка, тест)
C T (ref, cal)
После того, как значения C T измерены, различные методы могут быть использованы для определения
уровень экспрессии целевого гена в тестируемом образце относительно калибратора
образец. В следующих разделах мы представляем три метода относительного количественного определения
с использованием контрольного гена: 1) метод Ливака, также известный как метод 2 –∆∆C T , 2)
метод ∆C T с использованием эталонного гена и 3) метод Pfaffl. Каждый метод
имеет преимущества и недостатки, а также предположения, которые должны быть выполнены
чтобы результаты анализа были действительными.
Страница 45 |
количественный анализ данных ПЦР
относительная количественная оценка
4.2.3.1 Метод 2 - ∆∆ C T (Livak)
Метод 2 –∆∆C T для анализа относительной экспрессии генов широко используется и прост
выполнять. Этот метод предполагает, что и целевой, и эталонный гены
усиливается с эффективностью около 100% и в пределах 5% друг от друга. Перед использованием
метод 2 –∆∆C T , важно проверить допущения, определив
Эффективность амплификации мишени и эталонных генов. Усиление
Эффективность мишени и эталонного гена можно определить методом
изложенные в разделе 1.1.3.
После того, как вы установили, что целевой и эталонный гены имеют сходные и
почти 100% эффективности, вы можете определить относительную разницу в
Уровень экспрессии целевого гена в разных образцах, используя следующие шаги:
Во-первых, нормализуйте C T гена-мишени по сравнению с эталонным (ref) геном, для обоих
тестовый образец и калибратор образца:
∆C T (тест) = C T (цель, тест) - C T (ссылка, тест)
∆C T (калибратор) = C T (цель, калибратор) - C T (ссылка, калибратор)
Во-вторых, нормализуйте ΔC T испытуемого образца до ΔC T калибратора:
∆∆C T = ∆C T (тест) - ∆C T (калибратор)
Наконец, вычислите коэффициент выражения:
2 –∆∆C T = нормализованный коэффициент экспрессии
Полученный результат представляет собой кратное увеличение (или уменьшение) целевого гена в тесте
образец относительно калибратора образца и нормируется на выражение
эталонный ген. Нормализация экспрессии целевого гена по сравнению с
Эталонный ген компенсирует любую разницу в количестве образца ткани.
Если мишень и эталонные гены не имеют одинаковой эффективности амплификации
Вы можете либо оптимизировать, либо перепроектировать анализы, либо использовать метод Pfaffl.
описано в разделе 4.2.3.3 . Если, с другой стороны, цель и ссылка
гены имеют одинаковую эффективность амплификации, но эффективность не равна 2,
можно использовать модифицированную форму метода 2 –∆∆C T , заменив 2 в
уравнение по фактической эффективности усиления. Например, если усиление
Эффективность как мишени, так и эталонного гена составляет 1,95, формула 1.95 –∆∆C T
должен быть использован.
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени
41
Страница 46 |
анализ данных КПЦР в реальном времени
относительная количественная оценка
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени
42
Следующий гипотетический пример демонстрирует, как метод 2 –∆∆C T используется для
определить относительную экспрессию целевого гена (р53) в раковой и нормальной
клетки яичников.
Пример: кДНК, представляющие 50 нг общей РНК, выделенной как из нормальной, так и из
Опухолевые клетки яичника анализировали на p53 (целевой ген) и GAPDH (ссылка
ген) сообщение. GAPDH может служить эталонным геном для этого исследования, потому что
предыдущие исследования показали, что экспрессия GAPDH не изменяется между нормальными
и опухолевые клетки. Значения C T для каждого образца приведены ниже:
Образец
C T p53 (цель)
C T GAPDH (ссылка)
Нормальный (калибратор)
15,0
16,5
Опухоль (тест)
12,0
15,9
Чтобы вычислить относительное выражение , используя шаги , описанные выше, С Т из
целевой ген нормализован по отношению к C T эталонного гена для обоих тестируемых образцов
и образец калибратора:
∆C T (в норме) = 15,0 - 16,5 = –1,5
∆C T (опухоль) = 12,0 - 15,9 = –3,9
Во-вторых, ∆C T испытуемого образца нормируется на ∆C T калибратора:
∆∆C T = ∆CT (опухоль) - ∆CT (нормальное состояние)
= –3,9 - (–1,5) = –2,4
Наконец, коэффициент выражения вычисляется:
2 –∆∆C T = 2 - (- 2,4) = 5,3
Опухолевые клетки экспрессируют р53 в 5,3 раза выше, чем нормальные клетки.
4.2.3.2 Δ С
T
Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 439; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!