Анализ количества и качества нуклеиновой кислоты

⇐ ПредыдущаяСтр 12 из 16Следующая ⇒

Точное количественное определение нуклеиновых кислот имеет важное значение для анализа экспрессии генов,

особенно если общее количество РНК используется для нормализации экспрессии целевого гена.

Концентрации РНК и чистота обычно определяются путем измерения соотношения

УФ-поглощение при 260 нм и 280 нм. Общая чувствительность этого метода

низкий, особенно для относительно разбавленных образцов, и это не указывает на качество

РНК. Чтобы определить качество и количество вашего образца, мы рекомендуем использовать

автоматизированная система электрофореза Experion ™ (см. Руководство по продукту). Примеры

препарат тотальной РНК высокого качества и препарат тотальной РНК низкого качества

показано на рисунке 5.2.

Рис. 5.2. Качество РНК оценивали с помощью системы электрофореза Experion. А, пример высокого

качественный препарат тотальной РНК, демонстрирующий отчетливые пики для 18S и 28S рРНК; B, пример

некачественный препарат тотальной РНК, в котором наблюдаются только небольшие деградированные фрагменты.

Страница 53

анализ экспрессии генов

Подготовка матрицы кДНК (обратная транскрипция)

5.3 Подготовка шаблона кДНК

(Обратная транскрипция)

Для количественной оценки экспрессии генов с помощью RT-qPCR доступны два метода:

RT-qPCR «двухступенчатый» или RT-qPCR «одноступенчатый». В обоих случаях РНК является обратной

транскрибируется в кДНК, а затем кДНК используется в качестве матрицы для количественного

ПЦР-амплификация. «Одношаговый» и «двухступенчатый» относится к

Транскрипция и ПЦР-амплификация в реальном времени выполняются одинаково или раздельно.

трубы. В двухэтапном методе РНК сначала транскрибируется в кДНК в реакции

с использованием обратной транскриптазы. Аликвоту полученной кДНК затем можно использовать как

исходный шаблон для нескольких реакций КПЦР. В одношаговом методе обратный

Транскрипция и КПЦР выполняются в одной пробирке.

В двухэтапной RT-qPCR стадию RT можно инициализировать случайными олиго (dT) праймерами

праймеры, смесь двух или геноспецифических праймеров. RT-PCR за один шаг должен

быть выполненным с использованием геноспецифических праймеров, и может быть достигнуто либо с помощью

Thermus thermophilus ( Tth ) полимераза, ДНК-полимераза с присущей ей RT

активность, или с помощью двухферментной системы, объединяющей обратную транскриптазу с

термостабильная ДНК-полимераза. Поскольку Tth ДНК-полимераза происходит от

термофильная бактерия, более высокие температуры (> 60ºC) могут быть использованы для стадии RT,

который может минимизировать вторичную структуру в мРНК с высоким содержанием GC.

Точный анализ экспрессии генов требует хорошей воспроизводимости обратного

реакции транскрипции. Надежность обратной транскрипции определяется

чувствительность, динамический диапазон и специфичность используемой обратной транскриптазы.

Обратные транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV) и птичьего гриппа

Вирус миелобластомы (AMV) является наиболее часто используемым ферментом. Когда долго

или полноразмерные транскрипты кДНК, обратная транскриптаза MMLV и ее

производные являются лучшим выбором, чем обратная транскриптаза AMV из-за их более низкого

РНКазная активность Н Было отмечено, однако, что RT реакции выполняются

с РНКазой Н - обратные транскриптазы иногда требуют последующей РНКазы Н

лечение для эффективного усиления определенных шаблонов и тех, в низкой концентрации

в ПЦР.

Страница 54

анализ экспрессии генов

Разработка анализа КПЦР

Как отмечено выше, этап обратной транскрипции в двухступенчатой RT-qPCR может быть

выполняется с использованием олиго (dT) праймеров, случайных праймеров, смеси этих двух или

специфические праймеры. Выбор праймеров может повлиять на количественную оценку вашей цели

ген. Ген-специфические праймеры дают меньше фонового праймера, чем олиго (dT) или

случайные праймеры. Если вы выбираете олиго (dT) праймеры для обратной транскрипции, вы можете

хотите разместить ПЦР-праймеры близко к 3 'концу транскрипта, чтобы избежать потери

чувствительность из-за усеченных сообщений; это особенно важно для дольше

транскриптов. Следует избегать грунтовки Oligo (dT), если вы работаете с транскриптами

или виды, которые имеют короткие поли (А) хвосты или не имеют их вообще. Для 5'-нуклеазы

анализ показал, что кДНК с олиго (dT) -праймингом работает очень хорошо; однако случайным образом

праймированная кДНК работает одинаково хорошо или немного лучше для большинства последовательностей, и

намного лучше для некоторых последовательностей. Для большинства применений ПЦР мы нашли лучшие

производительность с использованием наборов для синтеза кДНК iScript ™ и iScript ™ Select, в которых используются

MMLV RT (см. Руководство по продукту).

5.4 Разработка анализа КПЦР

Анализы экспрессии генов могут быть выполнены как одноплексные или мультиплексные анализы,

используя много разных типов химии. Ваш экспериментальный дизайн будет зависеть от

как практические, так и научные соображения. Некоторые факторы, которые следует учитывать при

выбор между одноплексным и мультиплексным анализами обсуждается в разделе 2.2.1.

Для одноплексных анализов можно использовать любой химический состав, указанный в разделе 2.2.2. За

мультиплексные анализы, необходимо использовать химию на основе флуоресцентных праймеров или зондов,

такие как перечисленные в разделе 2.2.2.2; красители, связывающие дцДНК, не совместимы

с мультиплексными анализами.

Подробная информация о том, как спроектировать и оптимизировать тесты TaqMan для одно- и мультиплексных

приведены в разделе 2.4 и разделе 3; обратитесь к этим разделам за подробностями анализа

разработка и оптимизация. Обратите внимание, что для экспериментов по экспрессии генов, праймеры

должен быть спроектирован так, чтобы охватывать сплайсинговые соединения, чтобы избежать усиления геномной ДНК.

Страница 55

анализ экспрессии генов

экспериментирование

5.5 Эксперименты

Для определения экспрессии трех генов-мишеней, ODC, OAZ и AZI, и

эталонный ген, β-актин, в образцах A и B, эти четыре гена были оценены

в мультиплексном двухэтапном анализе RT-КПЦР.

Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 121; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 7 8 9 10 111213 14 15 16 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!