Метод с использованием эталонного гена

⇐ ПредыдущаяСтр 11 из 16Следующая ⇒

Метод ΔC T с использованием эталонного гена является разновидностью метода Ливака, который

Проще выполнить и дает по существу те же результаты. В отличие от

ΔC T значения, полученные в разделе 4.2.2, этот метод использует разницу между

контрольные и целевые значения C T для каждого образца. Несмотря на простоту

подход, это действительно нормализованное выражение. Уровень выражения ссылки

ген учитывается. Ключевое отличие в результатах заключается в том, что выражение

Значение калибратора образца не 1,0. Если в результате значения выражения

полученные по этому методу делятся на значение выражения выбранного калибратора,

результаты этого расчета точно такие же, как и полученные с

2 –∆∆C T метод:

Соотношение (ссылка / цель) = 2 C T (ссылка) - C T (цель)

Страница 47

анализ данных КПЦР в реальном времени

относительная количественная оценка

Математические предположения для этого подхода такие же, как и для

2 –∆∆C T метод.

Пример: кДНК, представляющая 50 нг общей РНК, выделенной как из нормальной, так и из

Клетки опухоли яичника анализировали в трех экземплярах на предмет сообщения р53 и GAPDH.

Предыдущие исследования пришли к выводу, что GAPDH является хорошим эталонным геном для этого

исследование. Результаты показаны ниже:

Образец

C T p53 (цель)

C T GAPDH (ссылка)

Нормальный (калибратор)

15,0

16,5

Опухоль (тест)

12,0

15,9

Чтобы вычислить относительное выражение, просто нормализуйте выражение p53 для каждого образца:

2 (C T (GAPDH) - C T (p53)) = выражение

Для нормальных клеток это дает 2 (16,5 - 15) = 2,8

Для опухолевых клеток это дает 2 (15,9 - 12) = 14,9

Хотя, на первый взгляд, эти результаты выглядят совершенно иначе, чем полученные

используя метод 2 –∆∆C T , можно быстро оценить соотношение между двумя образцами

покажет, что они дают точно такие же результаты:

Нормальное выражение = Normal / Normal = 2.8 / 2.8 = 1

Выражение опухоли = опухоль / нормальный = 14,9 / 2,8 = 5,3

Метод Пфаффля

Метод 2 –∆∆C T для расчета относительной экспрессии генов действителен только тогда, когда

Эффективность амплификации целевого и эталонного генов одинакова. Если

Эффективность усиления двух ампликонов не одинакова, альтернатива

Формула должна быть использована для определения относительной экспрессии целевого гена в

разные образцы. Определить соотношение экспрессии между образцом и

калибратор, используйте следующую формулу:

Соотношение =

(E target ) ∆C T , цель (калибратор - тест)

(E ref ) ΔC T , ref (калибратор - испытание)

Страница 48

количественный анализ данных ПЦР

относительная количественная оценка

В вышеприведенном уравнении E target и E ref являются эффективностями усиления цели

и эталонные гены соответственно. ∆C T , цель (калибратор - тест) = C T цели

ген в калибраторе за вычетом C T целевого гена в тестируемом образце, и

∆C T , ref (калибратор - тест) - это C T эталонного гена в калибраторе минус

C T эталонного гена в тестовом образце.

Приведенное выше уравнение предполагает, что каждый ген (цель и эталон) имеет одинаковый

Эффективность усиления в тестовых образцах и калибраторах, но это не обязательно

что целевые и эталонные гены имеют такую же эффективность амплификации, что и

друг с другом.

Метод 2 –∆∆C T и метод Пфаффля очень тесно связаны; на самом деле, 2 –∆∆C T

Метод является просто частным случаем метода Пфаффля, где E target = E ref = 2. Если мы

замените E target и E ref на 2, тогда метод Pfaffl упрощается следующим образом:

Соотношение =

= 2 - [(C T , цель (тест) - C T , цель (калибратор)] - [(C T , ссылка (тест) - C T , ссылка (калибратор)]

= 2 –∆∆C T

2 ∆C T , цель (калибратор - тест)

2 ∆C T , ref (калибратор - тест)

Страница 49

Экспрессия генов

Анализ

Экспериментальная дизайн

Изоляция РНК

Сбор образцов

РНК Экстракция

Анализ количества и качества нуклеиновых кислот

Подготовка матрицы кДНК (обратная транскрипция)

Разработка анализа КПЦР

Экспериментирование

Реакционные компоненты для мультиплексного анализа

Велоспорт протокол

Анализ данных генной экспрессии

Страница 50

анализ экспрессии генов

Экспериментальная дизайн

5. Экспрессия генов

Анализ

Наиболее распространенным применением ПЦР в реальном времени является изучение экспрессии генов.

Измерение экспрессии генов имеет фундаментальное значение во многих областях

современные биомедицинские исследования, от фундаментальной науки до практической

применения в промышленности и медицине. В большинстве исследований экспрессии генов

Исследователи заинтересованы в определении относительных уровней экспрессии генов в

Тест против контрольных образцов. Например, исследователь может быть заинтересован в

экспрессия определенного гена в раковых и нормальных тканях. В этой секции,

общие рекомендации и образец эксперимента по экспрессии генов представлены

продемонстрировать, как проводить анализ экспрессии генов с использованием ПЦР в реальном времени.

5.1 Экспериментальный дизайн

Образец анализа экспрессии генов с использованием мультиплексного анализа TaqMan представлен в

следующие разделы. В этом примере нас интересует относительное выражение

трех генов в пути биосинтеза полиаминов, орнитиндекарбоксилаза

(ODC), ODC-антизим (OAZ) и антизим-ингибитор (AZI) в двух разных образцах,

образец A и образец B. Из-за возможных ошибок пипетирования и первоначального количественного определения

ошибки ввода РНК, количество исходной кДНК в разное время

реакции могут быть разными. В этом примере экспрессия эталонного гена,

β-актин был выбран в качестве нормализатора для контроля любой разницы в вводе кДНК

количество. Следующие шаги были выполнены для определения относительного выражения

Уровень ODC, OAZ и AZI в двух разных образцах:

1. РНК была выделена из образца А и образца В.

2. РНК была обратно транскрибирована в кДНК.

3. Количество генов-мишеней (ODC, OAZ и AZI) и эталонный ген

(β-актин) определяли в каждом из образцов кДНК с использованием мультиплекса

анализ КПЦР.

4. Были проанализированы данные и относительная экспрессия каждого из генов-мишеней в

два образца были рассчитаны.

Страница 51

анализ экспрессии генов

рна изоляция

Этот рабочий процесс, типичный для экспериментов RT-КПЦР, обобщен в

Рисунок 5.1. В следующих разделах мы рассмотрим практические

выполнение каждого шага, указанного в рабочем процессе анализа экспрессии генов.

5.2 Изоляция РНК

Сбор образцов

Для количественной оценки экспрессии генов материал образца должен быть как можно более однородным.

насколько это возможно. Если ваш образец ткани состоит из множества различных типов клеток, точно

образец экспрессии вашего целевого гена может быть трудным. Если у тебя есть

гетерогенный образец, используйте один из многих методов, которые доступны для

выделение и выделение определенных типов клеток. Эти методы включают ткани

рассечение, биопсия иглы и микродиссекция лазерного захвата. Собранные

Затем клетки можно использовать для получения образцов РНК.

Рис. 5.1. Рабочий процесс анализа генной экспрессии.

Выделение РНК

Обратная транскрипция (RT)

Разработка анализа КПЦР

КПЦР эксперимент

Анализ данных

Страница 52

анализ экспрессии генов

рна изоляция

Экстракция РНК

Для большинства применений RT-qPCR в реальном времени можно использовать либо общую, либо поли (A + ) РНК.

Одно из важнейших соображений при работе с РНК - избегать РНКаз в ваших решениях,

расходные материалы и лабораторное оборудование. Готовые к использованию решения, не содержащие РНКазы, могут быть

купить. В качестве альтернативы обработайте растворы диэтилпирокарбонатом (DEPC) и

затем автоклавировать их. РНКазы на лабораторном оборудовании также могут быть деактивированы DEPC

обработка или выпекание при 250 ° С в течение 3 часов. Доступны расходные материалы без содержания РНКазы

для покупки из многих коммерческих источников.

Подготовленные образцы РНК могут нуждаться в обработке ДНКазой для предотвращения потенциальной

амплификация любой загрязняющей геномной ДНК, которая может привести к

завышение количества копий мРНК. Когда исходный материал

однако, лечение ДНКазой может быть нецелесообразным, так как

манипуляции могут привести к потере РНК. Усиление потенциала

загрязнение геномной ДНК может быть предотвращено путем разработки специфичного для транскрипта

праймеры, например, праймеры, которые охватывают или амплифицируются в местах сплайсинга.

Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 282; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 6 7 8 9 101112 13 14 15 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!