Проверка достоверности и оптимизация

⇐ ПредыдущаяСтр 7 из 16Следующая ⇒

Реакция qPCR на основе зонда TaqMan содержит следующие компоненты:

• ПЦР мастер-микс

• шаблон

• учебники для начинающих

• Зонд (ы)

Готовые смеси для ПЦР, содержащие буфер, ДНК-полимеразу и

dNTP коммерчески доступны от нескольких поставщиков. Для анализа TaqMan,

мы рекомендуем использовать супермикс iQ ™ с 300 нМ каждого из двух праймеров и

200 нМ зонда (ов).

Анализы TaqMan требуют внимательного отношения к температурным условиям. Типичный

Протокол TaqMan содержит этап денатурации с последующим комбинированным отжигом

и этап расширения при 55–60 ° C вместо традиционного трехступенчатого цикла ПЦР

денатурация, отжиг и удлинение. Это должно гарантировать, что зонд остается

связан с его целью во время расширения праймера. Типичные TaqMan-зонды для нуклеиновой кислоты

Количественная оценка рассчитана на T m 60–70 ° C.

Таблица 2.1. Обычно используются комбинации репортеров и гасителей.

Репортер

Совместимый гаситель

FAM

BHQ1, DABCYL, * TAMRA **

ТЕТ

BHQ1, DABCYL *

HEX

BHQ1, BHQ2, DABCYL *

TAMRA

BHQ2, DABCYL *

Техасский Красный

BHQ2, BHQ3, DABCYL *

ROX

BHQ2, BHQ3, DABCYL *

Cy5

BHQ2, BHQ3

* DABCYL - это механический гаситель, подходящий только для молекулярных маяков.

** TAMRA не рекомендуется в качестве гасителя, но будет работать для одноцветных анализов FAM. Тамра не будет

хорошо работать в качестве гасителя на молекулярных маяках.

Страница 29

начиная

разработка и оптимизация реакций зонда TaqMan

Оптимизированный анализ TaqMan должен быть чувствительным и конкретным и должен демонстрировать

хорошая эффективность усиления в широком динамическом диапазоне. Чтобы определить

Для выполнения анализа TaqMan используйте процедуру, описанную в разделах 1.1.3.

и 2.3.2. Короче говоря, построить стандартную кривую, используя разведения известного шаблона

и использовать эту кривую для определения эффективности анализа наряду с R 2 или r

линия регрессии. Эффективность реакции должна составлять от 90 до 105%,

R 2 должен быть> 0,980 или r> | –0,990 |, и повторы должны давать аналогичные

C T значения.

Если анализ выполняется в соответствии с этими спецификациями, вы готовы начать

эксперимент. Если анализ не соответствует этим требованиям, мы предлагаем вам

перепроектируйте свои учебники для начинающих и TaqMan.

Важно отметить, что диапазон концентраций матрицы, используемых для

стандартная кривая должна охватывать весь диапазон концентраций матрицы

тестовые образцы, чтобы продемонстрировать, что результаты тестовых образцов находятся в пределах

динамический диапазон анализа. Если тестовые образцы дают результаты за пределами диапазона

стандартная кривая, один из трех следующих шагов должен быть выполнен:

• Построить более широкую стандартную кривую, охватывающую концентрации тестируемого образца и

выполнить анализ, чтобы убедиться, что анализ является линейным в этом новом диапазоне

• Если испытуемые образцы дают более низкую C T, чем самая высокая концентрация стандартов

использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя разведенные образцы

• Если испытуемые образцы дают более высокий C T, чем самая низкая концентрация стандартов

использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя большее количество

тестовые образцы

Страница 30

Страница 31

мультиплексирование

Соображения

Дизайн грунтовки и зонда для мультиплексирования

Выбор репортеров и гасителей для мультиплексирования

Оптимизация индивидуальных анализов перед мультиплексированием

Валидация мультиплексных анализов

Оптимизация мультиплексных анализов

Страница 32

соображения мультиплексирования

конструкция праймера и зонда для мультиплексирования

3. Вопросы мультиплексирования

Если вы решили провести свои эксперименты с КПЦР путем усиления более

одна цель в одной реакционной трубе, то есть мультиплексирование (см. раздел 2.2.1),

Прочитайте следующий раздел, прежде чем начинать эксперименты.

Успешное мультиплексирование является результатом тщательного экспериментального проектирования и оптимизации

условий реакции, а не просто объединяя все праймеры и шаблоны в

та же трубка. Это потому, что усиление любой цели может влиять на

усиление других целей в той же трубке.

Распространенной проблемой для мультиплексной ПЦР в реальном времени является усиление целей, которые имеют

существенно разные концентрации. Пример исходит из генной экспрессии

исследования, в которых интересующий ген (GOI) сравнивают с эталонным геном. Если

Референтный ген присутствует в большом избытке и имеет более высокую эффективность амплификации

чем ГОИ, усиление ГОИ может быть вытеснено и, таким образом,

скомпрометирован амплификацией контрольного гена, когда оба амплифицированы в

та же трубка (мультиплексирована). Это приведет к недооценке суммы

GOI присутствует в образце.

Следующие шаги должны быть использованы для разработки мультиплексного анализа:

• Разработка последовательности праймеров и зондов

• Выберите репортеров и гасителей для зондов

• Оптимизировать индивидуальные анализы

• Проверить мультиплексный анализ

• При необходимости оптимизируйте мультиплексный анализ.

В следующих разделах мы подробно обсудим каждый из этих шагов.

3.1 Учебник для начинающих и исследования

для мультиплексирования

Если вы настраиваете мультиплексный анализ TaqMan, следуйте инструкциям в Разделе 2.4.

разработать индивидуальные анализы TaqMan. Дизайн всех праймеров с примерно

Т же м (55-60 ° С), и все зонды с приблизительно одной и той же Т м (~ 5-10 ° С

выше, чем праймеры). Важно убедиться, что разные праймеры и

наборы зондов не проявляют комплементарность друг другу, потому что все праймеры и

зонды будут присутствовать в одной реакции. Мы рекомендуем использовать в коммерческих целях

доступное программное обеспечение, такое как Beacon Designer, для упрощения разработки учебника и

наборы зондов для мультиплексных реакций.

Страница 33

соображения мультиплексирования

подбор репортеров и гасителей для мультиплексирования

3.2 Выбор репортеров и

Гасители для мультиплексирования

Мультиплексные реакции требуют использования нескольких репортеров, чтобы следить за каждым человеком

реакция амплификации. Чтобы отличить каждую реакцию, выберите репортер флуорофоров

с минимально перекрывающимися спектрами излучения. Выбранные флуорофоры также

должны быть совместимы с фильтрами возбуждения и эмиссии вашего реального времени

инструмент. См. Руководство к вашему инструменту для получения списка совместимых флуорофоров.

Например, для реакции четырехквартирного дома на Chromo4 ™ , Iq прибора Icycler ® и Iq ™ 5

инструменты, мы рекомендуем использовать FAM, HEX, Texas Red и Cy5. Для пятиплексного

Для анализа в системе iQ5 мы рекомендуем использовать FAM, HEX, TAMRA, Texas Red,

и Cy5.

3.3 Оптимизация индивидуальных анализов

Перед мультиплексированием

Первым шагом в сборке мультиплексного анализа является оптимизация отдельных реакций.

Определите эффективность каждой отдельной реакции, построив стандарт

Кривая с использованием серии шаблонных разведений, как описано в разделах 1.1.3 и 2.3.2 .

Эффективность отдельных реакций должна составлять 90–105%.

3.4 Валидация мультиплексных анализов

Проведите одноплексный и мультиплексный анализы для ваших целей на одной тарелке и

сравнить значения C T. Значения, полученные для данной цели в одиночном и

мультиплексные анализы не должны существенно отличаться. Если значения C T из

Singleplex и мультиплексная реакция значительно различаются, вам нужно будет

оптимизировать ваши реакции. Это может быть достигнуто путем изменения концентрации

компоненты реакции, как описано в разделе 3.5.

iQ ™ multiplex powermix значительно упрощает оптимизацию мультиплексных анализов, обычно

обеспечение одинаковой эффективности в одно- и мультиплексных анализах.

Страница 34

соображения мультиплексирования

оптимизация мультиплексных анализов

3.5 Оптимизация мультиплексных анализов

Если мультиплекс реакция не оптимизирована, усиление менее - эффективность или меньше -

обильная цель может быть ингибирована более - эффективными или более - обильными целями.

Это потому, что компоненты реакции, такие как ДНК-полимераза и нуклеотиды,

становятся ограничивающими в более поздних циклах и усиление менее - эффективно или менее -

Обильная цель скомпрометирована.

Этот ингибирующий эффект очевиден при сравнении графика усиления фиксированного

количество ампликона в однократной реакции на тот же ампликон в

мультиплексная реакция: C T для мультиплексной реакции задерживается по сравнению с C T

для одноплексной реакции. Это показано на рисунке 3.1, где усиление

из четырех мишеней, β-актин, орнитиндекарбоксилаза (ODC), ODC антизим (OAZ) и

антизим-ингибитор (AZI), проводился в однократных реакциях (синяя линия) и

в мультиплексной реакции с другими идентичными компонентами реакции (голубая линия).

Усиление два менее - обильных целей, ODC и азимут, был затронут,

и привело к задержанным значениям C T в мультиплексных реакциях по сравнению с

соответствующие одиночные реакции.

Рис. 3.1. Оптимизация концентрации ДНК-полимеразы iTaq ™ в четырехплексных реакциях. MgCl 2 и dNTP

концентрации были постоянными, в то время как концентрация iTaq в одноплексном режиме (1x) сравнивалась с мультиплексной

условия с использованием увеличения количества iTaq ДНК-полимеразы (1–4x). Гены β-actin и OAZ (те,

с самой высокой экспрессией в этом примере) были амплифицированы с одинаковой эффективностью в одиночном и мультиплексном

условия при всех протестированных концентрациях iTaq. Гены с более низкой экспрессией, AZI и ODC, требуются

дополнительная полимераза iTaq для достижения мультиплексной эффективности амплификации, сравнимой с

однократное усиление.

10000

1000

100

12 16 20 24 28 32 36 40

10000

1000

100

10000

1000

100

цикл

1000

100

цикл

β- актин

OAZ

AZI

ODC

лин

тра

тэ

- Singleplex, 1.25 U iTaq

- Fourplex, 1.25 U iTaq

- Fourplex, 2,5 U iTaq

- Fourplex, 3,75 U iTaq

- Fourplex, 5 U iTaq

Страница 35

Одним из способов оптимизации мультиплексных реакций является увеличение концентрации

ДНК-полимераза, дНТФ и MgCl 2 . Для оптимизации амплификации β-актина,

ODC, AZI и OAZ в мультиплексной реакции, мы последовательно увеличивали

концентрации ДНК-полимеразы, MgCl 2 и дНТФ.

Во-первых, мы увеличили концентрацию ДНК-полимеразы iTaq в мультиплексе.

реакция с шагом 1,25 единицы (U), от 1,25 U на реакцию до 5 U на реакцию.

При увеличении концентрации ДНК-полимеразы мы наблюдали увеличение

эффективность амплификации для ODC и AZI, как показано на рисунке 3.1. На основании этих

Данные, мы решили использовать 3,75 U ДНК-полимеразы на последующих этапах оптимизации.

Затем мы проверили эффект увеличения MgCl 2 с 3,5 мМ до 5 мМ и dNTPs

от 200 мкМ до 400 мкМ. Как показано на рисунке 3.2, когда ДНК-полимераза iTaq

концентрация была установлена на уровне 3,75 Ед на 50 мкл реакции, наш мультиплексный анализ с четырьмя генами

получено 5 мМ MgCl 2 без увеличения, необходимого для dNTP.

соображения мультиплексирования

оптимизация мультиплексных анализов

Рис. 3.2. Оптимизация концентраций MgCl 2 и dNTP в четырехплоскостных реакциях. Сохраняя

Константа концентрации iTaq ДНК-полимеразы при 3,75 U на 50 мкл реакции, влияние MgCl 2 и dNTPs

концентрации были оценены. Комбинация 5,0 мМ MgCl 2 , 200 мкМ dNTPs и 3,75 U iTaq ДНК

Полимераза дала лучшее усиление в мультиплексных реакциях (здесь не показаны одноплексные реакции).

лин

тра

тэ

10000

1000

100

12 16 20 24 28 32 36 40

β- актин

10000

1000

100

ODC

1000

100

AZI

1000

100

OAZ

цикл

MgCl 2

дНТФ

- 3,5 мМ 200 мкМ

- 3,5 мМ 400 мкМ

- 5,0 мМ 200 мкМ

- 5,0 мМ 400 мкМ

Страница 36

соображения мультиплексирования

optimization of multiplex assays

Рис. 3.3. Проверка эффективности мультиплексного анализа. Данные из однократного (синий) и четырехплексного (красный)

Реакции (четыре повторения, каждый с использованием кДНК простаты человека в качестве матрицы) накладываются. Сюжеты

полностью перекрываются во время экспоненциальной фазы. В таблице приведены средние значения C T для одиночного сплетения

и мультиплексные реакции.

лин

тра

тэ

10000

1000

100

β- актин

10000

1000

100

OAZ

10000

1000

100

ODC

1000

100

AZI

цикл

C T Значения

β- актин

ODC

AZI

OAZ

Singleplex

17,0 ± 0,0

23,0 ± 0,2

22,2 ± 0,1

20,8 ± 0,1

мультиплекс

17,3 ± 0,0

23,1 ± 0,2

22,2 ± 0,1

20,8 ± 0,2

12 16 20 24 28 32 36 40

Чтобы проверить эффективность оптимизированного мультиплексного анализа, мы выполнили

боковые сравнения одно- и мультиплексных реакций для каждого набора праймер-зонд при

оптимизированные условия (3,75 U iTaq, 5 мМ MgCl 2 , 200 мкМ dNTPs). В режиме реального времени

участки амплификации, генерируемые в одноплексных и мультиплексных условиях, должны

показывать одинаковые значения C T и быть наложенными во время экспоненциальной фазы

усиления. Успешные мультиплексные условия действительно были достигнуты, когда

используя образцы общей РНК из простаты человека (рис. 3.3) и тонкой кишки

(данные не показаны) в качестве шаблона.

Страница 37

КПЦР в реальном времени

Анализ данных

Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 113; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 678 9 10 11 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!