Как работает ПЦР в реальном времени

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 16Следующая ⇒

Чтобы понять, как работает ПЦР в реальном времени, давайте начнем с изучения образца

график усиления (рисунок 1.1). На этом графике номер цикла ПЦР показан на

ось х, и флуоресценция от реакции амплификации, которая пропорциональна

количество амплифицируемого продукта в пробирке показано на оси у.

График усиления показывает две фазы, экспоненциальную фазу, за которой следует

фаза неэкспоненциального плато. На экспоненциальной фазе количество

Продукт ПЦР примерно удваивается в каждом цикле. По мере протекания реакции

Однако компоненты реакции потребляются, и в конечном итоге один или несколько из

компоненты становятся ограничивающими. В этот момент реакция замедляется и поступает в

фаза плато (циклы 28-40 на рисунке 1.1).

Рис. 1.1. Усиление сюжета. Вычтена базовая флуоресценция.

лу

ре

0,3

0.2

0,1

Пороговая линия

Страница 8

обзор ПЦР в реальном времени

ключевые концепции ПЦР в реальном времени

Первоначально, флуоресценция остается на уровне фона и увеличивается флуоресценция

не обнаруживаются (циклы 1-18 на рисунке 1.1), даже если продукт накапливается

экспоненциально. В конце концов, достаточно амплифицированного продукта накапливается, чтобы дать

обнаруживаемый флуоресцентный сигнал. Номер цикла, при котором это происходит, называется

пороговый цикл, или С Т . Поскольку значение C T измеряется в экспоненциальной фазе

когда реагенты не ограничены, КПЦР в реальном времени может использоваться для надежного и

точно рассчитать начальное количество шаблона, присутствующего в реакции.

C T реакции определяется главным образом количеством матрицы, присутствующей в

начало реакции амплификации. Если большое количество шаблона присутствует на

В начале реакции потребуется относительно мало циклов амплификации, чтобы

накопить достаточно продукта, чтобы дать флуоресцентный сигнал выше фона.

Таким образом, реакция будет иметь низкий уровень, или в начале, C T . Напротив, если небольшое количество

шаблон присутствует в начале реакции, больше циклов амплификации будет

требуется для флуоресцентного сигнала, чтобы подняться выше фона. Таким образом, реакция будет

имеют высокий или поздно, C T . Эти отношения формируют основу для количественного аспекта

ПЦР в реальном времени. Подробная информация о том, как значения C T используются для количественной оценки образца

представлены в разделе 4.

Отличительные признаки оптимизированного анализа КПЦР

Поскольку количественная оценка в реальном времени основана на взаимосвязи между исходным шаблоном

количество и значение C T, полученные во время амплификации, оптимальный анализ КПЦР

абсолютно необходим для точного и воспроизводимого количественного анализа вашего образца.

Отличительными признаками оптимизированного анализа КПЦР являются:

• Линейная стандартная кривая (R 2 > 0,980 или r> | –0,990 |)

• Высокая эффективность усиления (90–105%)

• Согласованность повторяющихся реакций

Мощный способ определить, оптимизирован ли ваш анализ КПЦР, - запустить

серийные разведения шаблона и использовать результаты для получения стандартной кривой.

Шаблон, используемый для этой цели, может быть мишенью с известной концентрацией

(например, нанограммы геномной ДНК или копии плазмидной ДНК) или образец

неизвестное количество (например, кДНК). Стандартная кривая строится путем построения графика

журнал начального количества шаблона (или коэффициент разведения, для неизвестного

количества) от значения C T, полученного во время амплификации каждого разведения.

Уравнение линии линейной регрессии вместе с корреляцией Пирсона

Коэффициент (r) или коэффициент детерминации (R 2 ) затем можно использовать для оценки

оптимизирован ли ваш анализ КПЦР.

Страница 9

обзор ПЦР в реальном времени

ключевые концепции ПЦР в реальном времени

В идеале, ряд разведений будет давать кривые усиления, которые расположены равномерно,

как показано на рисунке 1.2 А. Если с каждым циклом усиления происходит идеальное удвоение,

расстояние между кривыми флуоресценции будет определяться уравнением 2 n =

коэффициент разбавления, где n - число циклов между кривыми при флуоресценции

порог (другими словами, разница между значениями C T кривых).

Например, при 10-кратном серийном разведении ДНК 2 n = 10. Следовательно, n = 3,32,

и значения C T должны быть разделены на 3,32 цикла. Равномерное усиление

Кривые будут давать линейную стандартную кривую, как показано на рисунке 1.2 B. Уравнение

и значение r линии линейной регрессии показано над графиком.

Значение r или R 2 стандартной кривой показывает, насколько хорошо экспериментальные данные

соответствовать линии регрессии, то есть насколько линейны данные. Линейность, в свою очередь, дает

мера изменчивости в анализе повторяет и ли амплификация

эффективность одинакова для разных начальных номеров копий шаблона. Значительный

разница в наблюдаемых значениях C T между повторностями понизит значение r или R 2 .

Вы должны стремиться к r, чье абсолютное значение> 0,990 или значение R 2 > 0,980 для

ваши реакции КПЦР.

Рис. 1.2. Генерация стандартной кривой для оценки оптимизации реакции. Стандартная кривая была сгенерирована

с использованием 10-кратного разбавления матрицы, амплифицированной в системе iCycler iQ ® в режиме реального времени. Каждое разведение анализировали в

тройные. А. Кривые усиления ряда разбавления. B, стандартная кривая с графиком C T относительно каротажа

начальное количество шаблона для каждого разведения. Уравнение для линии регрессии и значение r показаны

над графиком. Расчетная эффективность усиления составила 95,4%.

Страница 10

обзор ПЦР в реальном времени

ключевые концепции ПЦР в реальном времени

Эффективность усиления, E, рассчитывается по наклону стандартной кривой с использованием

следующая формула:

E = 10 –1 / уклон

В идеале количество продукта ПЦР будет идеально удваиваться в течение каждого цикла

экспоненциальное усиление; то есть будет увеличение в 2 раза

копии с каждого цикла. Это приводит к эффективности реакции 2. Использование

КПД, равный 2 в приведенном выше уравнении, 2 = 10 –1 / наклон , указывает на то, что оптимальный

наклон стандартной кривой будет -3,32. Обратите внимание, что абсолютное значение наклона

такое же, как идеальное расстояние флуоресцентных следов, описанных выше.

Эффективность усиления также часто представляется в процентах, то есть

процент шаблона, который был усилен в каждом цикле. Чтобы преобразовать E в

процент:

% Эффективность = (E - 1) x 100%

Для идеальной реакции% КПД = (2 - 1) х 100% = 100%.

Для примера, показанного на рисунке 1.2:

E = 10 - (1 / –3,436) = 1,954

% Эффективность = (1,954 - 1) х 100% = 95,4%

В конце каждого цикла число копий ампликона увеличивалось в 1,954 раза,

или 95,4% матрицы было амплифицировано.

Эффективность, близкая к 100%, является лучшим показателем надежного, воспроизводимого анализа.

На практике вы должны стремиться к эффективности усиления 90–105%. Низкий

Эффективность реакции может быть вызвана плохой конструкцией праймера или неоптимальной

условия реакции. Эффективность реакции> 100% может указывать на ошибку пипетирования в

ваши серийные разведения или коамплификация неспецифических продуктов, таких как

димеры. При использовании метода, описанного выше, для определения усиления

эффективность, присутствие ингибитора также может привести к очевидному увеличению

эффективность. Это потому, что образцы с самой высокой концентрацией матрицы также

имеют самый высокий уровень ингибиторов, которые вызывают задержку C T , тогда как образцы

при более низких концентрациях шаблона имеют более низкие уровни ингибиторов, так что С Т является

минимально задерживается В результате абсолютное значение уклона уменьшается, а

Расчетная эффективность увеличивается. Если эффективность вашей реакции <90% или

> 105%, мы предлагаем, чтобы вы изменили свой анализ, перепроектировав свои праймеры и

зонды. См. Разделы 2.3 и 2.4, где приведены рекомендации по проектированию праймеров и зондов.

Страница 11

Начиная

Общие Соображения

Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 137; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 123 4 5 6 7 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!