ДНК-связывающие красители (SYBR Green I)

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 16Следующая ⇒

Наиболее часто используемым ДНК-связывающим красителем для ПЦР в реальном времени является SYBR Green I,

который неспецифично связывается с двухцепочечной ДНК (дцДНК). СИБР Зеленый Я

проявляет небольшую флуоресценцию, когда он свободен в растворе, но его флуоресценция увеличивается

до 1000 раз, когда он связывает дцДНК (рис. 2.1). Поэтому в целом

флуоресцентный сигнал от реакции пропорционален количеству присутствующей дцДНК,

и будет увеличиваться по мере усиления цели.

ПЦР

Unbound SYBR Зеленый I

Связанный SYBR Green I

Рис. 2.1. ДНК-связывающие красители в ПЦР в реальном времени. Флуоресценция резко возрастает, когда краситель

молекулы связываются с дцДНК.

Страница 15

начиная

соображения экспериментального дизайна

Рис. 2.2. Анализ кривой плавления продукта реакции из анализа SYBR Green I. Анализ кривой плавления

Функция инструментов реального времени может использоваться для различения конкретных продуктов от неспецифических продуктов.

А. Отрицательная первая производная изменения флуоресценции представлена в виде функции температуры.

Два пика указывают значения T m двух продуктов ПЦР. Б. Гель-анализ продуктов КПЦР.

Дорожка 1, молекулярная линейка AmpliSize ® 50–2000 пар оснований (bp); дорожки 2 и 3, две копии КПЦР

продукт реакции, показанный в (А). Два продукта ПЦР выявляются отдельными полосами в геле.

Преимущества использования дсДНК-связывающих красителей включают простую конструкцию анализа

(требуется только два праймера; дизайн зонда не требуется), возможность тестирования нескольких

гены быстро без разработки нескольких зондов (например, для проверки гена

данные экспрессии от многих генов в эксперименте с микрочипами), более низкая начальная стоимость

(датчики стоят дороже), а также возможность выполнить анализ кривой плавления для проверки

Специфика реакции амплификации.

Анализ кривой плавления может быть использован для идентификации различных продуктов реакции, в том числе

Неспецифические продукты. После завершения реакции амплификации кривая расплава

генерируется путем увеличения температуры с небольшими приращениями и мониторинга

флуоресцентный сигнал на каждом шаге. Как дцДНК в реакции денатурирует (т. Е. Как

ДНК «плавится»), флуоресценция уменьшается. Первая отрицательная производная

изменение флуоресценции наносится на график как функция температуры. Характеристика

пик при температуре плавления ампликона (Т м , температура, при которой 50%

пары оснований дуплекса ДНК разделены) отличает его от других продуктов

такие как праймеры-димеры, которые плавятся при разных температурах. Примером этого

показано на рисунке 2.2. Пик расплава с Т м 89 ° С представляет собой удельный

продукта, и соответствует верхней полосе на дорожках 2 и 3 на геле. Пик

с Т м 78 ° С представляет собой неспецифический продукт и соответствует

нижняя полоса на дорожках 2 и 3 на геле.

Основным недостатком ДНК-связывающих красителей является их отсутствие специфичности, то есть

ДНК-связывающие красители связываются с любой дцДНК. В результате наличие неспецифического

продукты в реакции ПЦР в реальном времени могут способствовать общей флуоресценции и

влияет на точность количественного определения. Другим следствием является то, что ДНК-связывание

красители не могут быть использованы для мультиплексных реакций, потому что флуоресцентные сигналы от

разные ампликоны не различимы. Вместо этого вы можете настроить параллельное

реакции для изучения нескольких генов, таких как ген интереса и ссылки

ген, в ПЦР-анализе в реальном времени с SYBR Green I.

Страница 16

начиная

соображения экспериментального дизайна

Флуоресцентная химия на основе праймеров и зондов

Было разработано много химикатов на основе флуоресцентных праймеров и зондов, и

доступны от разных коммерческих поставщиков. Наиболее часто используемый зонд-

основанные на химии, TaqMan зонды и молекулярные маяки, подробно обсуждаются

ниже. Краткое описание других химикатов на основе флуоресцентных праймеров и зондов,

включая зонды Eclipse и праймеры Amplifluor, Scorpions, LUX и BD QZyme,

также представлены ниже.

Химические средства обнаружения на основе праймеров и зондов имеют некоторые общие черты.

Как правило, эти химические вещества используют энергию резонанса флуоресценции

перенос (FRET) или какая-либо другая форма гашения флуоресценции, чтобы гарантировать, что

специфическая флуоресценция обнаруживается только в присутствии амплифицированного продукта.

Праймер или специфичный для мишени олигонуклеотидный зонд помечен репортером

флуорофор; но в большинстве случаев олигонуклеотид сконструирован так, чтобы

флуоресценция гасится, когда конкретная цель недоступна. Обычно это

достигается путем присоединения молекулы-гасителя к зонду и разработки некоторых

механизм, с помощью которого репортер и гаситель разделены, когда зонд

привязывается к своей конкретной цели. Детали того, как каждая химия достигает этого

Разделение будет описано в следующих разделах.

В ПЦР в реальном времени флуоресцентные праймеры и зонды имеют два основных преимущества

поверх ДНК-связывающих красителей. Во-первых, они специально обнаруживают целевую последовательность так,

Неспецифические продукты не влияют на точность количественного определения. Во-вторых, они

позволяют выполнять мультиплексные реакции.

TaqMan Assays

В анализах TaqMan используется специфичный по последовательности флуоресцентно меченный олигонуклеотид

зонд, называемый зондом TaqMan, в дополнение к специфичным для последовательности праймерам.

Рисунок 2.3 иллюстрирует, как работают анализы TaqMan. Также известен как 5'-нуклеаза

В анализе TaqMan используется 5'-экзонуклеазная активность некоторых

термостабильные полимеразы, такие как Taq или Tth . Зонд содержит флуоресцентный

репортер на 5 'конце и гаситель на 3' конце. Когда нетронутой, флуоресценция

репортера гасят из-за его близости к гасителю. Вовремя

объединенная стадия отжига / удлинения реакции амплификации, зонд

гибридизуется с мишенью и dsDNA-специфичной 5 '-> 3' экзонуклеазной активностью

Taq или Tth отщепляется от репортера. В результате репортер отделен от

гаситель, и полученный сигнал флуоресценции пропорционален количеству

амплифицированный продукт в образце. Один обычно используемый флуоресцентный репортер-

Гаситель пара флуоресцеин (FAM, который испускает зеленую флуоресценцию) и черный

Гаситель отверстий 1. Для получения дополнительной информации о подходящих парах репортер-гаситель см.

Таблица 2.1.

Основные преимущества использования зондов TaqMan включают высокую специфичность, высокую

отношение сигнал / шум и способность выполнять мультиплексные реакции.

Недостатки в том, что первоначальная стоимость зонда может быть высокой, и анализ

дизайн не может быть тривиальным. См. Раздел 2.4.1 для получения подробной информации о дизайне анализа TaqMan.

Страница 17

начиная

соображения экспериментального дизайна

Молекулярные Маяки

В дополнение к двум специфичным для последовательности праймерам в молекулярно-маяковых анализах используется

специфичный к последовательности флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, называемый молекулярным

маяк, который представляет собой меченый красителем олигонуклеотид (25–40 нт), который образует шпильку

структура со стеблем и петлей (рисунок 2.4). Флуоресцентный репортер прикреплен к

5 'конец молекулярного маяка и гаситель присоединен к 3' концу.

петля предназначена для специфической гибридизации с 15–30 нуклеотидными срезами мишени

последовательность. По обе стороны от петли 5-6 нт, которые компл е тарные друг

другой, и образуют структуру ствола, которая служит для того, чтобы доставить репортера и гасителя

вместе. В структуре шпильки у репортера не обнаружено флуоресценции

из-за его физической близости к гасителю. На этапе отжига

В реакции амплификации молекулярный маяк связывается со своей последовательностью-мишенью,

разделение репортера и гасителя таким образом, чтобы репортер больше не гасился.

В отличие от анализов TaqMan, молекулярные маяки перемещаются, но не разрушаются во время

амплификации, потому что ДНК-полимераза, лишенная 5'-экзонуклеазной активности, является

используемый. Количество флуоресценции, испускаемой репортером на молекулярном маяке

пропорционально количеству мишени в реакции.

Молекулярные маяки имеют некоторые преимущества перед другими химическими препаратами. Они очень

конкретный, может использоваться для мультиплексирования, и если целевая последовательность не совпадает

последовательности маяка, гибридизации и флуоресценции не произойдет -

желательное качество для экспериментов аллельной дискриминации.

Основной недостаток использования молекулярных маяков заключается в их конструкции. Стебель

шпилька должна быть достаточно прочной, чтобы молекула не спонтанно складывалась

в не шпильки конформации, которые приводят к непреднамеренной флуоресценции. В то же

время, стержень шпильки не должен быть слишком сильным, или маяк не может

правильно гибридизировать с целью.

Рис. 2.3. Анализ TaqMan.

репортер

расширение

гаситель

Во время отжига зонд TaqMan связывается с

последовательность целей

Во время удлинения зонд частично смещен

и репортер раскололся. Бесплатный репортер

флуоресцирует

Страница 18

Другие химии

Гибридизационные зондовые анализы используют два специфичных для последовательности олигонуклеотида

зонды, в дополнение к двум специфичным для последовательности праймерам. Два зонда предназначены

связать с соседними последовательностями в цели, как показано на рисунке 2.5. Первый

зонд несет донорный краситель на своем 3'-конце, в то время как второй несет акцепторный краситель на

его 5 'конец. Донорный и акцепторный красители выбираются таким образом, чтобы излучение

спектр донорного красителя существенно перекрывается со спектром возбуждения

акцепторный краситель, в то время как спектр излучения донорного красителя спектрально разделен

из спектра излучения акцепторного красителя. Возбуждение осуществляется при

длина волны специфична для донорного красителя, а реакция контролируется на излучение

длина волны акцепторного красителя. На стадии отжига ПЦР зонды

гибридизуются с их целевыми последовательностями в расположении головы к хвосту. Это приносит

флуоресцентные молекулы в непосредственной близости, что позволяет энергии резонанса флуоресценции

перевод от донора к акцептору. Увеличение количества акцепторной флуоресценции

пропорционально количеству присутствующего ампликона.

начиная

соображения экспериментального дизайна

репортер

гаситель

Во время отжига зонд связывается с

целевая последовательность для отделения репортера и

гаситель. Репортер флуоресцирует

Молекулярные маяки - это шпильки-зонды с

репортер и гаситель

Рис. 2.4. Молекулярные маяки.

Донорский флуорофор

Акцепторный флуорофор

Во время отжига два зонда связываются

к цели в направлении головы к хвосту.

Акцепторный флуорофор флуоресцирует

Рис. 2.5. Гибридизационные зонды.

Страница 19

начиная

соображения экспериментального дизайна

Анализы КПЦР с использованием зонда Eclipse используют два праймера и последовательность-

специфический олигонуклеотидный зонд, как показано на рисунке 2.6. Зонд

дополняет последовательность внутри ампликона и содержит флуоресцентный

репортер на 3'-конце, гаситель на 5'-конце и небольшая связующая канавка.

Негибридизированный зонд принимает конформацию, которая приносит репортеру и

гасим вместе, гасим репортера. На этапе отжига ПЦР,

зонд гибридизуется с мишенью с помощью связующего вещества с малой канавкой.

Таким образом, зонд становится линеаризованным, разделяя репортер и гаситель и

позволяя репортеру флуоресцировать. Результирующий флуоресцентный сигнал пропорционален

количество амплифицированного продукта в образце.

Рис. 2.6. Затмение зондов.

репортер

гаситель

Незначительная канавка

Во время отжига зонд разворачивается и связывается

к целевой последовательности, чтобы отделить репортера

и гаситель. Репортер флуоресцирует

В неповрежденном зонде Eclipse репортер

гасится в непосредственной близости от гасителя

MGB

В анализах КПЦР с использованием химии Amplifluor используются два специфичных для мишени праймера и

один универсальный учебник под названием UniPrimer. Первый целевой специфический праймер содержит

5 'последовательность расширения, называемая Z-последовательностью, которая также находится на 3' конце

UniPrimer. Как показано на рисунке 2.7, UniPrimer образует шпилечную структуру.

Флуоресцентный репортер и гаситель прикреплены на 5 'и 3' концах

стволовая структура соответственно. В конформации шпильки, репортер флуоресценции

гасится из-за своей близости к гасителю. Во время первого цикла амплификации

первый целевой специфический праймер (с Z-последовательностью) гибридизуется с матрицей

и продлен. Во время второго цикла амплификации второй целевой

праймер используется для синтеза нового целевого шаблона, который содержит последовательность

дополняет Z-последовательность. Продукт со второго усиления

цикл может служить шаблоном для UniPrimer. В третьем усилении

цикл, расширенный UniPrimer служит шаблоном для следующего цикла амплификации.

В четвертом цикле расширение шаблона через область шпильки

UniPrimer заставляет UniPrimer открываться и принимать линейную конфигурацию,

Страница 20

что позволяет репортеру флуоресцировать. Экспоненциальное усиление с использованием второго

специфичный для мишени праймер и UniPrimer происходит в последующих циклах амплификации.

Результирующий флуоресцентный сигнал пропорционален количеству амплифицированного продукта в

образец.

В анализе праймеров Scorpions используются два праймера, один из которых служит в качестве зонда.

и содержит структуру петли стебля с 5 'флуоресцентным репортером и 3' гасителем,

как показано на рисунке 2.8. Последовательность петли зонда Scorpions:

комплементарен внутренней части последовательности-мишени на той же цепи.

Во время первого цикла амплификации праймер Scorpions удлиняется и

последовательность, комплементарная последовательности петли, генерируется на той же цепи.

Зонд Scorpions содержит блокатор ПЦР всего в 3 'от гасителя, чтобы предотвратить

Прочитать во время расширения противоположной нити. После последующего

денатурации и отжига, петля зонда Scorpions гибридизуется с

последовательность-мишень путем внутримолекулярного взаимодействия, и репортер отделяется

из гасителя. Результирующий флуоресцентный сигнал пропорционален количеству

амплифицированного продукта в образце.

При анализе праймеров LUX используются два праймера, один из которых представляет собой праймер в форме шпильки

с флуоресцентным репортером, прикрепленным около 3 'конца, как показано на рисунке 2.9.

В неповрежденном праймере репортер гасится вторичной структурой

шпилька. Во время амплификации праймер LUX включается в продукт и

репортер флуоресцирует.

начиная

соображения экспериментального дизайна

репортер

гаситель

UniPrimer отжигает последовательность

праймера Z и продлен

полимеразной

UniPrimer-содержащий продукт служит

в качестве шаблона для другого учебника

Удлинение праймера вызывает заколку

развернуть и отделить репортера и

гаситель. Репортер флуоресцирует

Z-праймер отжигает и расширяется в

первый раунд усиления

Рис. 2.7. Amplifluor грунтовка.

Страница 21

начиная

соображения экспериментального дизайна

репортер

Блокатор ПЦР

гаситель

Во время отжига шпилька-грунтовка связывает

к шаблону, а затем расширяется

Праймер Scorpions действует как зонд.

Неповрежденный праймер образует шпильку, так что

закаленный репортер не флуоресцирует

Во время последующей денатурации, репортер

отделяется от гасителя, и цикл

последовательность связывается с внутренней целевой последовательностью.

Репортер на расширенной грунтовке Scorpions

флуоресцирует

Рис. 2.8. Скорпион праймер.

Рис. 2.9. Праймеры LUX.

репортер

расширение

отжиг

денатурация

Праймер LUX образует шпильку, чтобы

закаленный репортер не флуоресцирует

Грунтовка становится одноцепочечной

Во время расширения праймер расширяется, и

репортер флуоресцирует в двухцепочечной

Продукт ДНК

Страница 22

начиная

соображения экспериментального дизайна

Анализы КПЦР с использованием праймеров BD QZyme используют специфичный для мишени зимоген.

праймер, специфичный для мишени обратный праймер и универсальный олигонуклеотидный субстрат в виде

показано на рисунке 2.10. Олигонуклеотид содержит флуоресцентный репортер на

5 'конец и гаситель на 3' конце. Когда олигонуклеотидный субстрат не поврежден,

Флуоресценция репортера гасится гасителем из-за их близости.

Зимогенный праймер содержит последовательность, которая кодирует каталитическую ДНК. В течение

В первом цикле амплификации зимогенный праймер удлиняется. Во втором цикле

продукт первого цикла используется в качестве шаблона для целевого обратного

праймер, который расширяется для создания новой последовательности-мишени, содержащей каталитическую

Область ДНК. На последующем этапе отжига флуоресцентно меченный

Олигонуклеотидный субстрат гибридизуется с каталитической последовательностью ДНК и расщепляется.

Это расщепление отделяет репортер от гасителя, что приводит к флуоресценции

сигнал, который пропорционален количеству амплифицированного продукта в образце.

расширение

Зимогенный праймер кодирует

каталитическая ДНК. Во время отжига

зимогенный праймер отжигает до мишени

Во время расширения каталитический

ДНК сделана

Во время следующего этапа отжига

каталитическая ДНК связывает зонд и

отщепляет репортера от гасителя

Свободный репортер флуоресцирует

денатурация

Отжиг зонда

репортер

гаситель

Рис. 2.10. Праймеры BD QZyme.

Страница 23

начиная

разработка и оптимизация реакций SYBR Green I

2.3 Разработка и оптимизация

SYBR Green I Реакции

В анализе SYBR Green I используется пара ПЦР-праймеров, которые амплифицируют конкретную область

в целевой последовательности интерес и включает SYBR Green 1 для обнаружения

амплифицированный продукт. Шаги для разработки анализа SYBR Green I:

• Дизайн грунтовки и дизайн ампликона

• Проверка достоверности и оптимизация

В разделах 2.3.1 и 2.3.2 приведены рекомендации по выполнению этих двух шагов.

Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 406; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 345 6 7 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!