Глава 21. ПАТОГЕННЫЕ МИКОПЛАЗМЫ

Классификация и номенклатура. Первые данные об изоляции микоплазм от животных отно­сятся к концу прошлого столетия, когда французские ученые Нокар и Ру открыли возбудителя поваль­ного воспаления легких (плевропневмонии) крупного рогатого скота. Выделенный микроорганизм был назван Asterococcus mycoides. Позднее он имел различные наименования, в том числе Mycoplasma pleuropneumoniae.

В 20-е годы нашего века подобные микроорганизмы были изолированы от овец, коз и других видов животных. По морфо­логическим и культуральным свойствам они напоминали возбу­дителя плевропневмонии крупного рогатого скота, поэтому их стали называть плевропневмониеподобными микроорганизмами (Pleuropneumonia like organisms – PPLO).

Международным комитетом по система­тике бактерий рекомендовано первоначально вид называть mycoides и род – Mycoplasma.

Одновременно с этим для дифференциации PPLO от бакте­рий в классе Schizomycetes (бактерий) первых включили в отряд Mycoplasmatales. С этого времени PPLO стали называть микоплазмами.

С учетом новейших данных о свойствах микоплазм они были объединены в самостоятельный класс Mollicutes в типе Protophyta. Следующим периодом классификации мико­плазм явилось предложение разделить их по потребности в холестероле. Микоплазмы, требующие для репликации холестерол, были включены в семейство Mycoplasmataceae, холестеролонезависимые – в семейство Acholeplasmataceae.

В 1954г. были изолированы PPLO, характеризующиеся формированием мельчайших колоний «tiny-form PPLO colo­nies», или Т-штаммы. По биологическим свойствам их отнесли к семейству Mycoplasmataceae, по способности гидролизировать мочевину и размножаться при рН 6,0 их идентифициро­вали как род Ureaplasma. В отличие от них классические мико­плазмы были отнесены к роду Mycoplasma.

В конце 60-х годов в результате изучения болезней расте­ний, ранее считавшихся болезнями вирусной этиологии, были выявлены микробы, названные микоплазмоподобными организ­мами – Mycoplasma Like Organisms (MLO), или микоплазмо­подобными агентами (MLA).

В результате интенсивных исследований микоплазм была разработана научная классификация, основанная на примере других прокариот. Прежде всего принято во внимание боль­шое число различных фенотипических признаков при их рас­пределении по различным таксономическим категориям.

N. Е. Gibbons и R. G. Murrey (1978) царство Procaryota предложили разделить на Gracillicutes (грамотрицательные), Firmicutes (грамположительные) и Mollicutes (безоболочечные).

Принадлежность микроорганизмов к классу Mollicutes определяется по следующим признакам:

1) отсутствие клеточ­ной стенки и наличие трехслойной плазматической мембраны;

2) резистентность к пенициллину;

3) отсутствие предшествен­ников клеточной стенки;

4) морфология колоний и клеток. Боль­шинство микроорганизмов растет колониями, форма которых напоминает яичницу-глазунью (fried egg), часто центру вра­стает в агар. При микроскопическом исследовании клеток наблюдается полиморфизм;

5) отсутствие реверсии в бактерии;

6) фильтруемость через поры размером 450 нм;

7) торможе­ние роста антителами;

8) содержание гуанина + цитозина в ДНК менее 46 мол %.

В классе Mollicutes имеется один отряд Mycoplasmatales.

В отряде Mycoplasmatales имеется 3 семейства: Myco­plasmataceae, Acholeplasmataceae, Spiroplasmataceae.

Принадлежность к различным семействам устанавливают на основании следующих таксономических признаков.

1. Морфология клеток. Полиморфность их характерна для Мycoplasmataceae и Acholeplasmataceae, геликальная форма – для Spiroplasmataceae.

2. Потребность в холестероле. Семейство Acholeplasmataceae не нуждается в холестероле, другие два – являются холестеролозависимыми.

3. Отношение к дигитонину и полианетолсульфонату натрия. Одни представители семейства Acholeplasmataceae резистентны к указанным веществам, другие – чувствительны.

4. Локализация энзимов амидадениндинуклеотид никотиновой кислоты и редуцированный амидадениндинуклеотид никотиновой кислоты. Эти энзимы находятся в цитоплазме клеток, принадлежащих к семействам Mycoplasmataceae и Spiroplasmataceae. В клетках семейства Acholeplasmataceae их регистрируют в мембране.

5. Размер генома. В клетках микроорганизмов семейства Acholeplasmataceae размер генома равняется 1х10⁹, у других двух семейств – 5х10⁸Д (дальтон).

В семействе Mycoplasmataceae имеется 2 рода – Мусоplasma и Ureaplasma. Дифференциация их основана на том, что уреаплазмы в отличие от микоплазм гидролизуют мочевину, культивируются при рН 6,0 и образуют весьма мелкие колонии. Семейство Acholeplasmataceae включает один род – Acholeplasma. Семейство Spiroplasmataceae также имеет один род – Spiroplasma.

Род Mycoplasma насчитывает 76 видов микоплазм, род Ureaplasma – 2, род Acholeplasma – 9, род Spiroplasma – 3.

Для определения вида, как морфологически сходных изолятов, используют следующие показатели.

1. Морфологические особенности при определенных условиях культивирования – образование и длина нитей, наличие спиралевидной формы, капсулярного материала, структурных элементов, форма колонии; подвижность.

2. Особенности культивирования. Потребность в некоторых питательных веществах, таких как бета-никотинамиддинуклеотид для М. synoviae, бактериальные липополисахариды для Аnaeroplasma bactoclasticum, потребность уреаплазм к концентрации водородных ионов в среде – рН 6,0; температура роста для спироплазм 25–30 °С, для анаэроплазм – анаэробные условия.

3. Катаболизм глюкозы, маннозы, гидролиз аргинина, эскулина и арбутина, образование фосфатазы, редукция тетразола, протеолитическая активность, гемадсорбция и гемагглютинация, образование нитей и пленки, а также каротиноидов.

4. Серологические свойства в реакциях ингибиции роста и метаболизма, а также иммунофлуоресценция. Для спироплазм пригодна также реакция деформации.

Указанные реакции не выявляют родства между видами. В то же время реакция преципитации в агаре и иммуноэлектрофоретическое исследование белков позволяют установить родство между определенными видами микоплазм, например, между штаммами аргининположительных видов.

5. Содержание гуанина + цитозина (Г + Ц) в ДНК.

6. Определение генетической связи штаммов по биохимическим и серологическим свойствам путем изучения гомологии их ДНК-штаммы, относящиеся к различным видам, имеют гомологию ДНК не более 10 %.

Категория подвидов означает группу штаммов, которые отличаются рядом биологических свойств. Однако по серологическим признакам и гомологии ДНК являются сходными. Существуют подвиды только среди представителей М. mycoides subsp. capri, M. mycoides subsp. mycoides.

Подвиды М. mycoides subsp. mycoides, M. mycoides subsp. capri и другие, как 7-й серотип по Личу или серотип L по Ал-Аубаиди, отличаются размером колоний, способностью разлагать казеин и разжижать протеин сыворотки, сохранять жизнеспособность при 45 °С.

Морфология. Микоплазмы – мельчайшие организмы, способные проходить через бактериальные фильтры и репродуцироваться как на бесклеточных питательных средах, так и в культуре клеток. Они характеризуются отсутствием истинной клеточной стенки, полиморфизмом.

В препаратах из трех-пятисуточных культур клетки располагаются небольшими скоплениями, нитями или хаотично по всему полю зрения. Наряду с этим обнаруживают мельчайшие репродуцирующие единицы размером 100–450 нм. Выборочные данные свидетельствуют о значительной морфологической вариабельности микроорганизмов порядка Mycoplasmatales и характеризуют превалирующие формы клеток у различных видов микоплазм. Многие из них имеют нитевидные, сферические и кокковидные формы.

В препаратах из культур М. mycoides subsp. capri превалируют нитевидные формы, М. gallisepticum – кокковидные, что учитывают при выявлении этих микроорганизмов в диагностических целях.

При выяснении микроструктурной организации микоплазм следует принимать во внимание: длину нитей, частоту их разветвления, стабильность структуры. Методом электронной микроскопии ультратонких срезов колоний микоплазм установлено, что крупные сферические и нитевидные клетки локализуются на поверхности, мелкие – в глубине.

Данные о морфологии различных видов микроорганизмов порядка Mycoplasmatales свидетельствуют о том, что визуальность микроорганизмов в препаратах зависит от фазы их роста, популяции, со­става питательной среды, техники подготовки препарата и окраски.

Цитоплазматическая мембрана микоплазм состоит из стериновых липидов, что сближает ее с эукариотами и отличает от других прокариот. Мембрана характеризуется высокой био­логической активностью, регулирует процессы метаболизма в клетке, энергетический обмен, рецепцию токсинов, обеспечивает адсорб­цию эритроцитов, эпителиальных клеток.

Репликация происходит почкованием, сегментацией ветви­стых и цепочечных форм, делением, что обусловливает поли­морфизм микроорганизма на разных стадиях онтогенеза.

Величина клеток различных видов микоплазм в культурах колеблется в пределах 120–300 нм, более мелкие проникают через бактериальные фильтры.

При электронно-микроскопическом исследовании в культу­рах 18–20-часового возраста микоплазмы представляют рых­лые образования неправильной круглой, каплевидной формы, не имеют выраженной клеточной оболочки. На жидких пита­тельных средах преобладают шаровидные образования. Они соответствуют наиболее известной форме микоплазм, описы­ваемой в литературе под названием элементарных тел, весьма типичных для жизненного цикла микоплазм.

Геном микоплазмы содержит примерно в 2 раза меньше генетической информации, чем ядерный аппарат других про­кариот.

По химической природе рибосомы состоят из рибонуклеиновой кислоты и белка, относятся к классу 70 S, типичному для клеток, не имеющих оформленного ядра.

Молекулярно биологические свойства. Микоплазмы лишены клеточной стенки, обладают простейшей структурой. Клетка окружена цитоплазматической мембраной, содержит цитоплазму, рибо­сомы и циркулярную двунитчатую ДНК.

Химический состав микоплазменной клетки. Мембрана составляет 15 % всей клетки. Она состоит из 47–60 % протеина, 35–37 % липида, 4–7 % углеводов, 1–4 % РНК и 1–2 % ДНК из расчета на сухое вещество.

Аминокислотный анализ мембрановых белков свидетельст­вует о наличии 14 различных аминокислот.

Липиды мембраны относятся к трем классам: нейтральные, гликолипиды и полярные липиды. Наиболее важными нейтраль­ными липидами являются каротиноиды у ахолеплазм и стерол у видов семейства Mycoplasmataceae и Spiroplasmataceae.

Углеводы представлены липополисахаридами или полисахаридами, отличающимися по структуре от углеводов грамотрицательных бактерий. Они обнаружены у некоторых видов ахо­леплазм, микоплазм; у спироплазм отсутствуют.

Липосахариды обладают иммуногенными свойствами. Они способны связываться с эритроцитами и эпителиальными клет­ками кролика. Добавление антител к указанной системе вызы­вает агглютинацию клеток и гемолиз.

Цитоплазма составляет 85 % всей клетки. Она состоит из протеина, хромосом и рибосом.

Влияние микоплазм на организм животного. Среди микроорганизмов рода Mycoplasma имеются виды, вызывающие патологические процессы у животных. Одновременно встреча­ются микоплазмы, которые находятся в тесной связи с клетками макроорганизма, но не вызывают симптомов заболевания. Опи­сана также группа сапрофитных штаммов, свободно живущих во внешней среде.

Патогенное воздействие микоплазм определяется способ­ностью этих микроорганизмов прикрепляться к клеткам хо­зяина. В этом процессе участвуют гликопротеины микоплазм, а также специальные органеллы, обнаруженные у некоторых видов микоплазм (М. gallisepticum, М. pulmonis, M. alvi). В распространении микоплазм в организме важны их активные движения. В процессе репликации ми­коплазмы используют в клетках макроорганизма аминокислоты, жирные кислоты – предшественники макромолекул, в том числе и ДНК. Образующиеся продукты обмена (аммоний, кислые про­дукты, пероксидаза, блокирующая метаболиты) нарушают нор­мальную функцию клеток макроорганизма. Снижается синтез белков, нуклеиновых кислот, реактивность клетки. В цитоплазме образуются вакуоли. Происходит набухание ядра клетки. Наблюдается рекомбинация хромосом. Нарушается движение жгутиков эпителиальных клеток, которые впоследствии подвер­гаются деструкции. Снижается выработка интерферона. Указан­ные явления приводят к ослаблению защитной функции ткани.

Микоплазмы, преодолевая тканевый барьер, проникают в кровяное русло. В этом процессе важную роль играет капсула микоплазм, гликолипиды которой токсичны для макроорга­низма: они снижают фагоцитоз и блокируют иммунокомпетентную систему. Некоторые виды микоплазм образуют токсины (М. gallisepticum), увеличивающие проницае­мость эндотелия капилляров, что обусловливает отечность различных тканей организма. В связи с этим развивается хрониче­ская инфекция, нарушается иммунологическая реактивность. Кроме того, в результате действия микоплазм изменяется мем­брана клеток макроорганизма.

Питание и метаболизм. Микоплазмы весьма требовательны к составу питательной среды. Патогенные штаммы нуждаются для репликации в сы­воротке крови млекопитающих, содержащей фактор роста, иден­тифицированный как липопротеин. Протеиновый компонент сыворотки, активно участвующий в обмене веществ микоплазм, является стерином, включающим различные аминокислоты.

Потребность в стерине – одно из важнейших классифика­ционных свойств микоплазм. Кроме стеринов, фосфолипидов, ацетонорастворимых липидов, патогенные виды микоплазм тре­буют присутствия белка, характеризующегося низкой молеку­лярной массой и содержанием аминокислот с преобладанием аргинина, лейцина, глицина, лизина. Заменителями белка могут служить сывороточный альбумин и бета-лактоглобулин.

Наиболее благоприятной температурой для культивирования микоплазм, уреаплазм, ахолеплазм является предел между 37–38 °С. Значительная часть штаммов культивируется при рН 7,8–8,0. Для уреаплазм оптимальным является рН 6,0. При культивировании важную роль играет предупреждение значи­тельного увеличения рН, в связи с чем культуры последова­тельно пассируют через каждые 6–12 ч.

Биохимические свойства. В дифференциации микроорганизмов класса Molicutes опре­делению биохимических свойств принадлежит важная роль. Ростовые потребности большинства микоплазм в стеролах являются одним из основных свойств, отличающих их от других прокариотических микроорганизмов.

В ряде тестов также определяют свойства микоплазм вы­зывать адсорбцию, агглютинацию и лизис эритроцитов. Поло­жительные результаты свидетельствуют о патогенном потен­циале микоплазм. Гемадсорбция, гемагглютинация – показа­тели способности этих микроорганизмов повреждать клетки: организма хозяина, что является фактором, способствующим развитию патологического процесса.

Ферментация углеводов. По способности усваивать углеводы микоплазмы разделяют на две большие группы – ферменти­рующие и неферментирующие. Наиболее специфичным является отношение к глюкозе. Реакция основана на показателях рН во время роста микроорганизмов, определении кислоты в присут­ствии глюкозы или гексокиназной активности.

Ферментация глюкозы в аэробных и анаэробных условиях характерна для семейства Acholeplasmataceae и Spiroplasmataceae, а также родов Mycoplasma, Termoplasma, Anaeroplasma. В аэробных условиях глюкоза окисляется до ацетата и дву­окиси углерода.

Гидролиз аргинина. Способность вызывать гидролиз арги­нина типична для спироплазм и некоторых видов рода Myco­plasma. Ахолеплазмы и уреаплазмы при использовании этого теста дают отрицательный результат.

Гидролиз мочевины. Уреазная активность является одним из наиболее важных свойств дифференциации уреаплазм от других микроорганизмов класса Mollicutes. Учитывая, что уреаз­ная активность обусловлена гидролизом мочевины на СО₂ и аммоний, определяют ее по результатам наблюдения за алкалинизацией культур на питательных средах, содержащих 1 % мочевины. С этой же целью применяют метод окрашивания колоний в среде с хлоридом магния.

Гемагглютинация, гемадсорбция, гемолиз. Реакцию с эри­троцитами используют для идентификации и характеристики микоплазм. Гемагглютинацию применяют как тест, основанный на добавлении красных кровяных клеток к суспензии мико­плазм. Гемадсорбция – процесс осаждения эритроцитов коло­ниями микоплазм, а также ахолеплазм, гемолиз – растворение их. Гемадсорбция тормозится иммунной сывороткой.

Предполагается существование зависимости между патогенностью и способностью микоплазм к гемагглютинации, гем­адсорбции и гемолизу.

Наряду с биохимическими тестами представляют интерес эксперименты, направленные на изучение таксономических осо­бенностей представителей семейства Mycoplasmataceae, вклю­чающих пенициллиноустойчивость. Результаты их свидетельствуют о том, что различные штаммы рода Mycoplasma резистентны к пенициллину, используемому в дозах 1–10 тыс. ЕД/мл среды.

Установлено, что пенициллин, бактериостатическое действие которого в основном обусловливается влиянием на синтез клеточной оболочки, подавляет рост микоплазм только в высоких концен­трациях. В опытах с культурами М. agalactiae, угнетающие рост дозы пенициллина составляли 10–25 тыс. ЕД/мл. В противоположность этому специфическому эффекту препараты тетрациклинового ряда, а также мономицин, линкомицин, действующие на процессы об­мена в клетке и цитоплазматической мембране, инактивировали микоплазмы в низких концентрациях: биомицин и моно­мицин – 10–100 ЕД/мл, канамицин –400–2000 мкг/мл.

Вопрос об отношении различных видов Mycoplasma к пени­циллину и ацетату таллия имеет большое теоретическое и практическое значение. Имеется в виду широкое использование указанных препаратов в лабораторной практике при подготовке патологического материала для изоляции микоплазм и изго­товлении питательных сред для их культивирования.

Антигенная структура. Микоплазмы обладают сложной антигенной структурой. Антигены у них локализуются в мембране или цитоплазме. По химическому составу они могут быть полисахаридными, про­теиновыми и гликолипидными.

Мембранные антигены являются очень важными в реакции между микоплазмами и макроорганизмом.

Полисахаридные антигены. Вокруг мембраны некоторых ви­дов микоплазм находится капсула. У вида М. mycoides subsp. mycoides она состоит из галактана, в котором галактоза на­ходится в форме фуранозы. Это вещество реагирует с рутеин красным (он связывает полианионы), а также с антисывороткой в реакции преципитации и связывания комплемента. Галактан серологически идентичен с галактаном клеток легких крупного рогатого скота, что и является причиной аутоиммунной реакции животных при заражении указанным видом микоплазм и разрушения клеток легких при перипневмонии крупного рогатого скота.

Протеиновые антигены. Белки мембраны могут быть расположены как на наружной, так и внутренней поверхности мембраны. Анализ мембранных протеинов в полиакриламидном геле методом электрофореза позволил обнаружить 50–60 различных фракций полипептидов, отличающихся один от другого молекулярной массой.

Гетерогенность микоплазменных антигенов. Значительное антигенное различие отмечают между штаммами, относящимися к родам Mycoplasma, Ureaplasma, Acholeplasma, Spiroplasma. Выраженную гетерогенность антигенов наблюдают также у ви­дов, принадлежащих к одному роду, которая является одним из критериев для их идентификации.

Гетерогенность антигенов отмечают, прежде всего, в реакциях ингибиции роста, ингибиции метаболизма, ингибиции роста и преципитации, микоплазмацидной пробе, иммуноферментном анализе. Это особенно отмечают среди видов, ферментирующих глюкозу, гидролизующих аргинин, но не наблюдают у видов, относящихся к различным биохимическим группам. Антигенное родство особенно четко выявляют в реакции преципитации.

Реакция ингибиции метаболизма основана на действии анти­тел на антигены, локализованные в мембране, при этом блокируются различные энзимы, принимающие участие в метаболизме клетки. Этот процесс можно контролировать путем измерения ингибиции разложения субстрата среды, как, например, глюкозы, аргинина, мочевины, трифенилтетразольхлорида, метиленовой сини.

В реакции ингибиции метаболизма различают две фазы: фазу первоначального ингибирования, которую также наблю­дают и в контрольной пробе, содержащей одни микоплазмы (она не зависит от дозировки и сопровождается изменением рН среды на 0,5 сразу же после внесения микоплазм), и фазу конечного ингибирования метаболизма. Отмечают значительное изменение рН среды под влиянием иммунной сыворотки. Титры ее зависят от дозы микоплазм, и результаты остаются стабиль­ными, не влияя на длительность инкубации.

При сравнении антигенов различных штаммов одного и того же вида микоплазм обычно преобладает гомологичность анти­генов. Только у некоторых видов (М. mycoides subsp. mycoides) отмечают гетерогенность штам­мов, но она проявляется не во всех реакциях. Поэтому при определении принадлежности штаммов к виду рекомендуется применять несколько серологических реакций. Кроме того, у этих же видов микоплазм гетерогенность явно не выражена и в титрах серологических реакций.

21.

---

Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 339; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!