Возбудитель казеозного лимфоденита

Казеозный лимфоденит (псевдотуберкулез) – межзональная природно-очаговая инфекцион­ная болезнь, характеризующаяся гнойно-некротическим воспалением соматических и висцеральных лимфатических узлов, а также органов и тканей.

Термин «псевдотуберкулез» был предложен в 1883 г. Эбертом на основании внешнего сходства поражений в органах животных с теми, которые известны при туберкулезе. Однако возбудитель псевдотуберку­леза не имеет ничего общего с микобактериями туберкулеза и название «псевдотуберкулез» сегодня представляет лишь исторический смысл.

Возбудителем болезни является Corynebacterium pseudotuberculosis из се­мейства энтеробактерий (Enterobacteriaceae), рода иерсиний (Yersinia).

Токсигенность. Возбудитель казеозного псевдотуберкулеза синтезирует экзотоксин и обладает активными эндотоксинами белковой природы. Некоторые штаммы в бульонных культурах образуют сильный токсин.

Антигенная структура. Данный микроб имеет сложную антиген­ную структуру: в его состав входят 5 жгутиковых (Н)–а, в, с, d, e и 12 соматических гладких (О) – 1–12 антигенов, кроме того, имеется один шероховатый антиген, общий для всех иерсиний. Гладкие антигены яв­ляются типовыми и соответственно им различают пять серологических типов, однако повсеместно преобладают бактерии первого типа. Шеро­ховатый (R) антиген имеют все иерсинии, он общий и с возбудителем чумы.

Патогенез. Проникнув алиментарным или аэрогенным путем через поврежденную кожу или пуповину, бактерии оседают в региональных лимфатических узлах, либо с током крови разносятся по всем тканям и органам и вызывают септецимию. В результате пиогенного и токсического действия возбудителя на организм происходит гнойное воспаление лимфоузлов, появляются гнойно-некротические фокусы в легких, печени, кишечнике, селезенке, матке, вымени и других органах, нарушается кровоообращение, поражается центральная нервная система. Гибель происходит в результате асфиксии, сердечной недостаточности и кахексии.

Диагностика. Материалом для бактериологического исследования являются лимфатические узлы, кусочки патологически измененных паренхиматозных органов. Для серологического диагноза можно использовать сыворотку. Схема исследования включает: бактериоскопию, выделение чистых культур и биологический метод.

Из исследуемого материала готовят мазки, которые окрашивают по Граму и Романовскому–Гимзе. Посевы проводят на МПА, МПБ, а также специальные обогащенные среды, дифференциальную среду Се­рова или агар Хоттингера с генцианвиолетом в концентрации 1 : 200 000. Заражают подкожно белых мышей или лучше морских свинок. Мыши гибнут на 3–7-е, свинки на 3–13-е сутки.

Пастереллы

Пастереллез,или геморрагическая септицемия (Pasteurellosis)–инфекционная болезнь домашних и диких животных, в том числе птиц, вызываемая бактериями из рода Pasteurella. При остром течении характеризуется признаками септицемии и геморрагического диатеза, а при подостром и хроническом – преимущественно поражением легких.

Возбудитель – в основном Pasteurella multocida, реже – другие представители рода Pasteurella.

Морфология. P. multocida – короткие эллипсоидные палочки длиной 0,3–1,5 мкм и шириной –0,15–0,25 мкм. Располагаются изолированно, иногда парами и реже цепочками. Величина и форма палочек несколько варьирует в зависимости от происхождения: культуры, выделенные от крупного рогатого скота, однородны, вытянутой формы; от свиней более овальные; от птиц – более округлые.

При культивировании на щелочном агаре и в жидких средах с уг­леводами пастереллы располагаются в виде цепочек. Пастереллы грамотрицательны, неподвижны, в мазках из крови и органов характерна биполярная окраска, иногда с выраженной капсулой (особенно штам­мы, выделенные от свиней) с высоким содержанием гиалуроновой ки­слоты.

Культивирование. Пастереллы – аэробы и факультативные анаэробы. Образуют ин­дол и сероводород, реакция Фагес – Проскауэра отрицательная, нитра­ты восстанавливают до нитритов. Мочевину не разлагают, разрушают перекись водорода.

Ферментируют сахара, спирты и глюкозиды с образованием только кислоты: глюкозу, сахарозу, фруктозу, сорбит, галактозу, маннозу, как правило, маннит, ксилозу и трегалозу. Не ферментирует лактозу, дульцит, раффинозу, рамнозу, адонит, декстрин, инулин, глицерин, салицин, мальтозу и арабинозу. Однако ферментация углеводов непостоянна и видовым признаком считается способность ферментировать глюкозу, сахарозу, маннозу и галактозу. Встречаются биохимические варианты (штаммы, ферментирующие арабинозу, дульцит и лактозу, не фермен­тирующие ксилозу и т. д.), что не дает оснований к внутривидовой диф­ференциации пастерелл.

Пастереллы растут на разнообразных средах, но лучше в присутст­вии крови (или сыворотки крови), на средах Хоттингера и Мартена. Обязательными компонентами среды должны быть никотинамид и пантотенад, а ростовыми факторами – гуанин, ксантин, глютамин, инозит, пиридоксин, n-аминобензойная кислота, витамин В₁₂, фолиевая кис­лота, биотин и гематин.

Патогенность. P. multocida обладает широким диапазоном патогенности. Наряду с этим встречаются штаммы, патогенные для определен­ного вида животных. Еще большей изменчивости подвержена вирулент­ность. Замечено, что пастереллы, выделенные из трупов через 6–9 ч. после гибели животных, в 10 раз вирулентнее (для белых мышей) по сравнению с теми же культурами, выделенными в момент смерти жи­вотных. Свежевыделенные штаммы, как правило, патогенны для мы­шей, кроликов и голубей. Штаммы от крупного рогатого скота весьма вирулентны для белых мышей и кроликов, но не вирулентны для уток и кур, штаммы же от птиц вирулентны для лабораторных животных и птиц. В лабораторных условиях пастереллы утрачивают или резко сни­жают свою вирулентность. Доказано, что она связана с гладкой фор­мой колоний; слизистые менее вирулентны, шероховатые – слабовиру­лентны или совсем непатогенны.

По данным многих исследователей, штаммы, образующие капсулу, высоковирулентны для мышей (капсулу рассматривают как фактор вирулентности). К числу важных свойств относится образование токсинов (эндотоксинов).

Предполагается, что сужение диапазона патогенности P. multoci­da – следствие утраты способности противостоять ингибиторному дей­ствию крови соответствующих видов животных.

Устойчивость пастерелл невысока. Максимальная выживаемость в почве и воде – 26 дней, в навозе и по­мете – 72 дня, в трупах–120 дней. При 70–90 °С эти микробы погибают через 5–10 мин, при 1–5 °С – через несколько дней. Эффективны обыч­ные дезинфицирующие средства (5 %-ное известковое молоко, 3 %-ная го­рячая эмульсия ксилонафта,и 2 %-ный раствор едкого натра).

Антигенная структура. P. multocida имеет два антигена: капсульный (К-антиген) и соматический (О-антиген). По Картеру К-антигены делят на четыре серологических типа: А, В, D и Е. К-антиген присущ гладкому варианту и не встречается у шероховатых форм. У слизистых культур (М-форма) К-антиген или отсутствует, или не определяется из-за наличия гиалуроновой кислоты. Утрата способности реагировать с капсульными сыворотками – признак диссоциации культуры. К-антигены состоят из белка и полисахаридов. В химическом отношении О-антигены представляют собой липополисахаридно-белковый комплекс, а по биологическим свойствам сходны с соответствующими антигенами дру­гих бактерий и являются эндотоксинами. В состав полисахарной части эндотоксина входят галактоза, глюкоза, глюкозамин и гептозы. Кроме К- и О-антигенов, P. multocida содержит многие другие, из них только растворимых обнаружено 18.

В силу полиморфности антигенной структуры отдельные штаммы пастерелл могут резко отличаться друг от друга.

Иммунитет. Вопрос об антигенах, стимулирующих иммунитет при пастереллезе, не совсем ясен. По-видимому, главную роль играют К- и О-антигены. После перенесенной болезни и вакцинации создается, как правило, нестерильный иммунитет. Поэтому животные могут оставать­ся пастереллоносителями (особенно птицы).

Сыворотки крови переболевших животных агглютинируют гомологичные и гетерологичные штаммы пастерелл. Защитная активность им­мунных сывороток обычно направлена против тех типов пастерелл, ко­торые вызвали болезнь. Наряду с этим имеются указания, что при пастереллезе птиц отмечается клеточная реакция.

Патогенез. Достаточно не изучен. Пастереллез возникает спонтанно в результате распространенного носительства или заносится больными и переболевшими животны­ми. Инкубационный период может быть от 1 до 5 суток, а при пастереллоносительстве неопределенный срок.

Развитие и тяжесть патологического процесса зависят от состояния животного и вирулентности возбудителя. Состояние биологического равновесия при носительстве пастерелл обеспечивается иммунной перестройкой организма. Переход пастереллоносительства в клинически выраженную стадию болезни происходит при ослаблении за­щитных свойств макроорганизма под действием различных предрасполагающих фак­торов. При остром течении болезни возбудитель интенсивно размножается в крови и паренхиматозных органах. В развитии патологических процессов важную роль игра­ют токсические продукты пастерелл (эндотоксины), а также высокая степень агрес­сивности возбудителя, вероятно, связанная с капсулообразованием.

Клиническая картина. При пастереллезе птиц инкубационный период при сверх­остром течении болезни исчисляется часами, а при остром– 2–3 днями. Сверхостро болезнь протекает лишь у отдельных птиц в начале эпизоотии: внезапно возникают сильное угнете­ние, судороги, посинение гребня, быстро наступает летальный исход. Чаще отмечают острое течение болезни (от 12 ч. до 3 сут). Температура тела повышается до 43–43,5 °С, появляют­ся вялость, снижение аппетита и сильная жажда, птица пере­двигается с трудом. К концу болезни гребень и сережки синеют, а при поражении легких затрудняется дыхание, из носовых отверстий и клюва выделяется пенистый экссудат. У боль­шинства птиц отмечают понос, фекалии с примесью крови. При подостром течении (5–10 дней) пастереллеза клинические призна­ки аналогичны, но болезнь разви­вается медленнее.

Симптомокомплекс холеры при хроническом течении зависит от резистентности птиц и локализации возбудителя. Отмечают слабость, снижение аппетита, понижение яйценоскости, истощение, анемию. Часто диагностируют ринит, конъюнктивит, опухание бородок, нередко – и артриты, обусловливающие хромоту.

Пастереллез овец может протекать молниеносно, остро, подостро и хронически. При молниеносном течении болезни внезапно повышается температура тела, нарастает слабость, быстро наступает смерть. Острое течение (до 5 дней) характе­ризуется подъемом температуры до 41–42 С, отсутствием ап­петита и сильным угнетением животного. Затем отмечают се­розное или слизисто-гнойное истечение из носа, конъюнктивит, затрудненное дыхание, кашель; при перкуссии устанавливают очаги притупления в легких, а при аускультации – хрипы. У некоторых животных появляются отеки в области межчелю­стного пространства, подгрудка, возникает понос. У взрослых овец болезнь может принять хроническое течение. Признаки по­ражения легких ослабевают, но истощение прогрессирует. Не­редко развивается паренхиматозный мастит, и даже некроз вы­мени.

Пастереллез свинейможет протекать как самостоятельная септицемическая болезнь и как вторичная инфекция при дру­гих вирусных и бактериальных болезнях. Чаще болеют поросята-отъемыши и животные из группы откорма. Различают сверх­острое, острое и хроническое течение пастереллеза. Инкубаци­онный период 1–3 дня, но бывает – до 14 дней. При сверх­остром течении болезнь начинается внезапным повышением температуры (до 42 °С), угнетением, отказом от корма, жаждой, учащенным и затрудненным дыханием, сердечной слабостью. Иногда развивается фарингит. Через 1–2 дня наступает ле­тальный исход.

Острое течение болезни характеризуется, кроме описанного симптомокомплекса, развитием фибринозной плевропневмонии. Отмечают одышку, сильный кашель, синюшность видимых сли­зистых оболочек носового зеркальца и ушей, а позднее и ниж­ней части живота. Тип дыхания брюшной, свиньи принимают позу «сидящей собаки». Температура тела повышена до 41–42,5 °С. Животное погибает через 3–8 дней при нарастающих признаках сердечной слабости и затруднения дыхания. У некоторых свиней болезнь принимает хроническое течение, при ко­тором симптомы поражения легких ослабевают, но слабость и истощение прогрессируют.

Патологоанатомические изменения. При сверхостром и ост­ром пастереллезе на вскрытии обнаруживают множественные кровоизлияния под серозными и слизистыми покровами, в под­кожной клетчатке. При преимущественном поражении органов дыхания устанавливают лобарную крупозную пневмонию, фиб­ринозный плеврит и перикардит; в грудной полости обнаружи­вают серозно-фибринозный экссудат. При подостром и хрониче­ском течении болезни в пораженных долях легкого могут быть очаги некроза, устанавливают дистрофию печени и миокарда.

Диагноз. Клинико-эпизоотологические данные недостаточны для постановки диагноза, но характерная патологоанатомическая картина при остром течении болезни и положительные ре­зультаты бактериологического исследования с биопробой дают возможность окончательно подтвердить диагноз.

При вто­ричных пастереллезных пневмониях, осложняющих вирусные болезни свиней, обычно выделяют слабовирулентные культуры пастерелл.

Возбудители гемофилезов

Среди заболеваний животных в последние десятилетия большую экономическую значимость приобретают болезни, вызы­ваемые гемофильными бактериями, – гемофилезы.

Гемофильные бактерии – возбудители этих болезней являют­ся постоянными обитателями слизистых оболочек верхних дыха­тельных путей многих видов животных. Их относят к группе по­тенциально патогенных микроорганизмов, проявляющих болезне­творные свойства при определенных условиях, чаще на фоне ослабления резистентности организма или на фоне некоторых ин­фекций (парагрипп, грипп и др.).

Постоянное наличие в крупных хозяйствах и комплексах жи­вотных разного возраста, движение их по технологической цепочке, сопровождаемое объединением групп, гиподинамия маточного пого­ловья и врожденная агаммаглобулинемия нарождающегося молод­няка, а следовательно, и низкая резистентность их к болезнетвор­ному действию микробов составляют основной набор факторов, предрасполагающих к заболеванию гемофилезами.

Пассируясь через организмы животных с низкой устойчивостью к болезням, гемофильные бактерии усиливают потенциальную патогенность и, распространяясь воздушно-капельным путем, приоб­ретают способность вызывать заболевание у больших групп жи­вотных.

В настоящее время наибольшую экономическую значимость приобрели гемофилезы свиней и птиц. Среди свиней, главным об­разом отъемного возраста, во многих странах мира известны две болезни, вызываемые микроорганизмами рода Haemophilus,– гемофилезный полисерозит (болезнь Глессера) и гемофилезная плев­ропневмония, а среди птиц – гемофилез кур. У крупного рогатого скота описана инфекция, обусловленная Н. somnus, проявляющаяся клиническими признаками поражения дыхательных путей, тромбоэмболическим менингоэнцефалитом.

Классификация и характеристика гемофильных бактерий

Гемофильные (гемоглобинофильные) бактерии – это группа микроорганизмов, которые в ходе эволюции паразитизма утратили способность самостоятельно синте­зировать некоторые коферменты, играющие у бактерий важную роль в процессах биологического окисления. В естественных условиях источником необходимых био­логически активных веществ для гемофильных бактерий являются ткани макроорганизма. В лабораторных усло­виях для их культивирования нужны специальные пи­тательные среды, содержащие ростовые факторы.

Гемофильные бактерии – это полиморфные, корот­кие палочки или коккобактерии размером 0,5 × 0,2–0,3 мкм, спор не образуют, неподвижные, факультатив­ные анаэробы, грамотрицательные, некоторые виды име­ют капсулу. Они постоянно обитают на слизистых обо­лочках респираторного тракта и половых органов.

В род Haemophilus вклю­чено 19 видов, из них 14 считаются таксономически яс­но очерченными (Н. influenzae, H. suis, H. haemolyticus, Н. parainfluenzae, H. parasuis, H. parahaemolyticus, Н. haemoglobinophilus, H. influenzae murium, H. gallinarum, H. paraphrophilus, H. paragallinarum, H. paraphrohaemolyticus, H. aphrophilus, H. ducrey) и пять (H. ovis, H. putoriorum, H. citreus, H. piscium и Н. aegiptius) рассматриваются как виды с неясным система­тическим положением. В па­тологии сельскохозяйственных животных основное значение имеют: Н. suis, Н. parasuis, H. parahaemolyticus, H. gallinarum, H. ovis, Н. paragallinarum, H. citreus.

Дифференциация известных видов гемофильных бак­терий основывается на изучении потребности культур в V- и Х-ростовых факторах, сыворотке крови живот­ных, углекислом газе, на определении продукции гемо­лизина, индола, сероводорода, ферментации углеводов и наличия различных ферментов.

Типовым видом рода Haemophilus является Н. in­fluenzae, играющий среди гемофильных бактерий веду­щую роль в патологии человека. Этот вид характеризу­ется абсолютной зависимостью от V- и Х-ростовых факторов и по современной классификации в зависимо­сти от ферментативной активности отдельных штаммов подразделяется на пять биотипов. Биотиповая принад­лежность штаммов в определенной степени коррелирует с патогенными свойствами (например, максимальной вирулентностью отличаются культуры первого биотипа). Н. influenzae обитает в верхних дыхательных путях человека и при снижении общей резистентности организма способен вызывать синуситы, пневмонии, менингиты, эпиглотиты. Особенно значительна роль возбудителя в развитии менингитов и других остро протекающих ин­фекционных болезней у детей. По биологическим свой­ствам и экологии Н. influenzae наиболее близок к па­тогенным для животных Н. suis, H. parasuis, H. para­gallinarum.

От свиней гемофильная бактерия впервые была вы­делена и идентифицирована как Н. influenzae suis. Однако первые глубокие исследования роли гемофильных бактерий в инфекцион­ной патологии свиней проведены при изучении гриппа. Этиологию этой болезни установили лишь в 1931 г. Р. Шоуп и Р. Леви, которые доказали обусловленность болезни совместным воздействием вируса гриппа и гемофильной бактерии Н. influenzae suis. Позднее эти результаты подтверждены отечественными исследовате­лями.

Н. parasuis может обусловливать у поросят менин­гиты, воспаление серозных оболочек, артриты. Генера­лизованная инфекция Н. parasuis получила название болезни Глессера.

Большое значение в патологии свиней имеет бакте­рия Н. pleuropneumoniae, обусловливающая остро проте­кающую фибринозно-некротизирующую пневмонию. Впервые возбудителя описали П. Метьюз и И. Паттисон (1961).

У кур гемофильные бактерии впервые выделил при заразном насморке в 1932 г. Де Блик. Они были охарак­теризованы как зависимые от V- и Х-ростовых факторов. Ц. Мак Грауей (1932), Л. Пейдж (1962) и другие ис­следователи изучили ростовые потребности культур гемофильных бактерий, изолированных от кур, и сделали вывод, что они не нуждаются для роста в Х-факторе (гемин).

Н. Хинц (1973) считает необходимым дифференциро­вать куриные гемофильные бактерии на два вида, но не по признаку потребности в ростовых факторах, а по другим фенотипическим свойствам. К виду Н. paragal­linarum в настоящее время относят ДПН-зависимые, патогенные для кур штаммы, нуждающиеся для куль­тивирования в повышенном содержании СО₂. Н. para­gallinarum рассматривается как возбудитель заразного насморка кур (коризы кур). Апатогенные для кур штам­мы, рост которых не зависит от наличия СО₂ в атмосфе­ре, названы Н. avium.

У крупного рогатого скота известна инфекционная болезнь, обусловленная Н. somnus. Этот микроорганизм ассоциируется с респираторной патологией крупного рогатого скота, он вызывает специфическую инфекцию у животных с преимуществен­ным поражением центральной нервной системы. Иногда Н. somnus является причиной заболеваний генитальных органов у крупного рогатого скота.

Зависимость роста культур Н. somnus от V- и Х-рос­товых факторов установить не удалось. Для этого вида ростовым фактором является кофермент тиаминпирофосфат (кокарбоксилаза).

Культивирование. Гемофильные бактерии относятся к факультативным анаэробам; некоторые из них для своего роста нужда­ются в повышенном содержании СО₂ в атмосфере. Тем­пературный оптимум, как правило, составляет 37–38 °С, рН среды 7,2–7,6. Их отличительной особенностью яв­ляется потребность в специфических ростовых факторах.

Общепринятые питательные среды непригодны для культивирования гемофильных бактерий. Все среды для их выращивания должны содержать специальные рос­товые факторы, что достигается добавлением в основную среду крови, свежего стерильного экстракта дрож­жей или чистых препаратов ростовых факторов –V-фактора, Х-фактора.

Некоторым видам гемофильных бактерий требуются оба указанных ростовых фактора, другим только один из них. В соответствии с этим питательные среды под­разделяют на универсальные, обеспечивающие рост всех классифицированных видов рода Haemophilus, и предназначенные для культивирования только Х- или V-зависимых видов.

В качестве универсальных питательных сред чаще применяют шоколадный агар и среду Левинталя.

Для культивирования всех видов бактерий, кроме шоколадного агара и среды Левинталя, могут быть ис­пользованы агар Хоттингера, МПА и МПБ с добавле­нием гемина и ДПН. Кристаллический гемин в количестве 0,1 г растворяют в 100 мл 1 %-ного водного раствора Na₂CO₃ и стерилизуют автоклавированием при 120 °С в течение 45 мин. Раствор хранят при 4–5 °С в течение 12 мес.

Гемин термостабилен, и его можно добавлять в горячую питательную среду из расчета 10–20 мкг/мл.

Энзиматически чистый дифосфопиридиннуклеотид (ДПН, адениндинуклеотид) хорошо растворяется в воде, тер­молабилен. Приготовленный водный раствор ДПН сте­рилизуют фильтрацией через фильтр Зейтца и добав­ляют в жидкую или в расплавленную и охлажденную до 45–50 °С плотную питательную среду. Его оптималь­ная концентрация в питательных средах для V-зависимых видов гемофильных бактерий составляет около 10 мкг/мл. Раствор ДПН или среды, содержащие его, до использования хранят в темноте при 4–5 °С не более 8–10 сут.

Широко используют в качестве источника дифосфопиридиннуклеотида рас­тущие культуры многих видов бактерий, которые спо­собны синтезировать и выделять экстрацеллюлярно в процессе роста на питательных средах биологически активный ДПН. Практически с этой целью исследуе­мый материал или изучаемую культуру засевают газо­ном на МПА или агар Хоттингера в чашках Петри, После этого по диаметру чашки крестообразно в виде непрерывной линии бактериологической петлей засева­ют «питающую» культуру бактерий, чаще Е. coli и S. albus. Эти виды бактерий в процессе роста выделяют ДПН, который диффундирует в толщу агаровой среды. В зоне диффузии ДПН, вблизи «питающей» культуры – так называемой баккормилки, способны расти колонии.

Различные виды бактерий-кормилок в разной степени стимулируют рост V-зависимых гемофилов (табл. 13).

Таблица 13. Интенсивность сателлитного роста Н. parasuis в зависимости от вида баккормилки.

	Штаммы			H. parasuis
Питающие культуры	A-9	В-26	C-5	Д-74	№ 1	№10
В. subtilis	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +	+ +
В. anthracoides	+ +	+ +	+ +	+ +	+ + +	++
S. albus	+ +	+ +	+ +	++	+ +	+ +
Е. coli	+	+	+	+	+	+
P. aeruginosa	+	+	+	+	+	+

Примечание: +++ интенсивный, ++ умеренный и + слабый сателлитный рост.

Как видно из таблицы, В. subtilis и. В. anthracoides стимулируют рост ДПН-зависимого вида бакте­рий в большей степени, чем другие виды питающих культур. Вероятно, это обусловлено в первую очередь более быстрым ростом данных видов бацилл, что в ко­нечном итоге раньше обеспечивает накопление в пита­тельной среде необходимой концентрации ростового фактора.

Следует отметить, что в процессе роста питающей культуры в среду поступают, кроме ДПН, и другие био­логически активные вещества, которые способны стимулировать рост гемофильных бактерий. Последнее обстоятельство, видимо, и объясняет случаи, когда V-зависимые гемофильные бактерии удается культивировать на питательной среде с баккормилкой, тогда как рост культуры может отсутствовать на среде, содержащей только энзиматически чистый ДПН. Недостатком этого способа культивирования является быстрая гибель гемофильных бактерий (через 3–4 сут), что обусловлено токсическим действием продуктов метаболизма баккормилки и изменением рН питательной среды. Поэтому при первичном выделении культуры гемофильных бактерий или их пассировании с помощью баккормилок отвивку колоний на оптимальные питательные среды желательно производить через 48–72 ч. инкубирования посевов.

Для выделения культур гемофильных бактерий из патологи­ческого материала наи­более часто использу­ют кровяной МПА (5–10 % крови бара­на) с баккормилкой. Большинство гемофилов растут на кровя­ном агаре в виде сателлитных колоний около питающей куль­туры.

Источником ДПН может служить не только активно растущая питающая культура бактерий, но и стерили­зованная фильтрацией культуральная жидкость этого микроорганизма, выращенного в жидкой питательной среде. Однако такой метод получения V-фактора сей­час практически не применяется.

Биохимические свойства. Определение потребности в ростовых факторах. Идентификация представителей рода гемофилюс неиз­бежно связана с анализом их потребности в ростовых факторах. В данном случае подразумеваются не просто различные вещества, обеспечивающие рост микроорга­низмов (источники азота, углерода и т. д.), а соедине­ния, которые определенные виды бактерий сами синте­зировать неспособны. Гемофильные бактерии, будучи облигатными паразитами, получают в естественных экологических условиях эти ростовые факторы в готовом виде из животных тканей. Применительно к гемофильным бактериям речь идет, как правило, о двух ростовых факторах (V и X), участвующих в дыхательном процессе V-фактор в сочетании с дегидрогеназами участвует в переносе электронов в дыхательной цепи, обеспечивая окислительно-восстановительные реакции клеточного метаболизма. Большинство бактерий синтезируют этот ростовый фактор из никотиновой кислоты, но ряд ге­мофильных бактерий не обладает этой способностью. Кофермент (V-фактор) разрушается при температуре 120 °С, чувствителен к кислотам и щелочам. Природ­ными источниками этого фактора могут быть животные, растительные ткани, клетки многих видов бактерий.

Х-фактор идентичен гемину крови, термостабилен. Физиологическая роль его тесно связана с активацией процесса дыхания. Это обусловлено тем, что важней­шие дыхательные ферменты (цитохром С, пероксидаза, каталаза и др.) содержат в качестве активной простетической группы цикл гематина.

По отношению к Х-фактору все бактерии могут быть разделены на три группы. Группа гемофильных Х-зависимых видов (Н. influenzae, H. haemoglobinophilus, Н. ducrey) утратила способность синтезировать слож­ные циклы гематина, вследствие чего для их культиви­рования питательные среды обогащают Х-фактором. Другая группа микробов (В. anthracis, В. abortus и т. д.) способна синтезировать геминовый цикл из более простых продуктов метаболизма. Третья группа, преимущественно анаэробные микроорганизмы (C. tetani, C. botulinum и др.), не содержащие гематина, осуществляют окислительно-восстановительные процес­сы без участия геминовых ферментов.

Следует иметь в виду, что Х-фактор термоустойчив и определение Х-потребности гемофильных бактерий осложняется возможным наличием его следов в пепто­не и мясном экстракте, которые обычно используют для изготовления питательных сред.

Определение зависимости роста исследуемой куль­туры на искусственных питательных средах от V- и Х-факторов является одним из основных моментов в родовой и видовой идентификации гемофильных бакте­рий. В зависимости от набора реагентов и питательных сред эту процедуру можно проводить различными спо­собами.

При наличии чистых препаратов дифосфопиридин-нуклеотида (V-фактор) или гемина (Х-фактор) опре­делить зависимость от ростовых факторов можно пу­тем культивирования исследуемой культуры на одной из обычных плотных или жидких питательных сред, до­бавляя к ним в оптимальных концентрациях один из указанных факторов роста или оба. Наиболее удобно с этой целью культивировать исследуемую культуру на плотных средах с дисками фильтрованной бумаги, пропитанными растворами ростовых факторов. В этом случае в качестве питательной среды берут подсушен­ный простой или сывороточный МПА в чашках Петри.

На первом этапе принципиально важно убедиться, что исследуемая культура хорошо растет на оптималь­ной универсальной питательной среде (шоколадный агар, агар Левинталя и т. д.), предназначенной для культивирования гемофильных бактерий, и не разви­вается на обычных питательных средах (МПА, МПБ, ПЖА, сывороточный МПА, МПБ). Это дает основание предположить, что культура бактерий относится к ро­ду Haemophilus. На втором этапе устанавливают, ка­кой из ростовых факторов необходим данному микро­организму. Целесообразно начинать с посева культуры на МПА (сывороточный МПА) с баккормилкой. Если культура растет на указанной питательной среде толь­ко в виде сателлитных колоний, то ее следует относить к V-зависимому виду, не требующему для роста Х-фактора. Если культура не растет на МПА с баккормил­кой, то она нуждается для роста или только в Х-факторе, или же в обоих факторах (X+V). В этом случае для уточнения ростовых потребностей изучаемую куль­туру высевают на автоклавированный шоколадный агар или на агар с добавлением автоклавированного основ­ного бульона Левинталя. Наличие роста на этих средах позволяет отнести культуру к виду, требующему один Х-фактор. Способность культуры расти только на уни­версальной питательной среде первой группы свидетельствует об ее зависимости как от Х-, так и от V-факторов.

Биохимические свойства гемофильных бактерий. Ферментацию углеводов изучают в жидких и полужид­ких средах, в которые добавляют 0,2 % сахаров и сте­рильные растворы ДПН и гемина из расчета 10 мкг/мл. При изучении свойств Н. paragallinarum, H. parasuis, Н. suis дополнительно к среде необходимо добавлять сыворотку крови.

Определение редукции нитратов до нитритов. В буль­он Левинталя добавляют 0,1 % KNO₃, стерилизуют в ав­токлаве и засевают исследуемой агаровой культурой. Посев инкубируют 5 сут. при 37–38 °С, а затем вносят две капли реактива Грисса. Красное или розовое окра­шивание среды свидетельствует о наличии в ней нитри­тов; следовательно, культура обладает способностью редуцировать нитраты.

Для обнаружения продукции исследуемой культу­рой индола засевают ее в мясо-пептонный бульон, со­держащий ДПН и гемин (по 10 мкг/мл), или бульон Левинталя и в пробирку помещают индикаторную бу­мажку, прижимая верхний конец ватной пробкой. Индикаторная бумажка представляет собой полоску филь­тровальной бумаги размером 0,8x5 см, пропитанной горячим 12 %-ным раствором щавелевой кислоты и вы­сушенной при комнатной температуре. Пробирки с по­севами инкубируют при 37–38 °С в течение 1–2 сут. Культуры, образующие индол, вызывают окрашивание индикаторной бумажки в розовый цвет.

При исследовании продукции оксидазы в качестве реактива используют раствор тетраметил-1,4-фенил-диамин-дигидрохлорид в 0,015 М фосфатном буфере. На плотную белую бумагу помещают одну бактерио­логическую петлю агаровой культуры и сверху наносят на бактериальную массу каплю реактива. Положитель­ным результатом считается появление голубоватого окрашивания. В качестве контроля используют культу­ры Е. coli – отрицательная реакция, В. bronchiseptiса – положительная реакция, P. multocida – слабая положительная реакция.

Определение каталазы. На предметном стекле в кап­ле 3 %-ного раствора перекиси водорода размешивают при помощи бактериологической петли суточную ага­ровую культуру. При наличии каталазы в жидкости появляются пузырьки газа.

---

Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 192; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!