Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний: ПЦР, секвенирование генома, ДНК-чипы. Геносистематика.
В некоторых случаях встаёт задача не просто идентифицировать какого-либо возбудителя, а с большей долей вероятности сказать, что это именно конкретная форма возбудителя, специфичность которому придаёт один или несколько генов. Встаёт задача определить, есть ли у выделенного возбудителя эти гены. Такую задачу решает ПЦР – полимеразная цепная реакция.
Сущность этой реакции, если говорить обзорно, заключается в амплификации молекул ДНК, т.е. многократном её копировании с образованием большого числа идентичных фрагментов.
Для полноценной ПЦР необходимы следующие компоненты:
- ДНК, подвергаемая амплификации;
- два праймера;
- термостабильная ДНК-полимераза;
- дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;
- ионы Mg2+;
- буферный раствор, содержащий обычно бычий альбумин и соли
Ход реакции:
1. Денатурация (плавление) – молекулу ДНК нагревают до 95 
на несколько минут, при этом цепи ДНК расходятся
2. Отжиг, когда температуру понижают, чтобы праймеры могли соединиться с соответствующими концами двух цепей ДНК. Обычно осуществляется в течение 30 секунд при температуре 50-70 ;
3. Элонгация, когда происходит наращивание дочерних цепей ДНК. Обычно проводится в течение 1 мин при температуре 72-74 .
Далее цикл обычно повторяют 25-40 раз.
Для анализа полученной ДНК используют обычно разделение амплификационной смеси электрофоретическим методом. Электрофорез осуществляют в полиакриламидном геле. При электрофорезе молекулы движутся в электрическом поле к катоду или аноду в соответствии со своим зарядом и массой, и это называется электрофоретической подвижностью, причём амплификационная смесь разделяется на разные полосы в зависимости от пройденного молекулой пути.
|
|
|
Секвенирование генома .
Это реализуемая сейчас широко возможность «читать» генетические тексты, т.е. последовательность молекулы ДНК. Наиболее перспективным толчком для развития молекулярной биологии послужил проект «Геном человека», запущенный в 1990 году, в ходе которого на протяжении 10 лет осуществлялась расшифровка последовательностей нуклеотидов, было установлено, что в геноме человека 30-40 тысяч генов. Полная расшифровка завершилась в 2003 году.
Основным методом секвенирования генома является секвенирование по Сенгеру (предложен метод в 1977 году).
Для реализации метода используют 4 пробирки, в которых находятся растворы 4 дезоксирибонуклеотидов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), причём в каждой пробирке помечено радиоактивным изотопом одно из 4 азотистых оснований. В каждую пробирку добавляют праймер, одну из цепей ДНК (подвергается секвенированию) и ДНК-полимеразу. После получения достаточного количества копий смеси подвергают действию рестриктаз (аналогично было с ПЦР), а далее смесь подвергается электрофорезу в полиакриламидном геле, получают линии на разных уровнях.
|
|
|
На приведённом выше фрагменты показано, как эти полосы выглядят на самом деле.
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 572; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!