ПОДГОТОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
4.1. ПОЛУЧЕНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ
Кровь крысы (2-3 мл) собирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 0,5 ч при 37 °С. По истечении указанного времени тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, кровь центрифугируют (10 мин, 3000 об/ мин). Полученную сыворотку сливают в чистую пробирку.
4.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПЕЧЕНИ КРЫС
Реактивы: 1. Среда выделения: 25 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5 при 4°С), 1 ммоль/л раствор MgCl2, 5 ммоль/л раствор дитиотрейтола, 1 мг/мл сывороточного альбумина.
2. 0,9 % раствор NaCl.
Ход работы: Животных декапитируют, печень быстро извлекают и промывают охлажденным 0,9 % раствором NaCl. Навеску ткани в 1 г измельчают ножницами и гомогенизируют 1 мин в 9 мл среды выделения, используя стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 300 g на рефрижераторной центрифуге. Надосадочную жидкость отбирают и центрифугируют 15 мин при 1500 g.
Всю работу по выделению плазматических мембран проводят на холоду.
4.3. ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ
Реактивы: 1. Среда выделения: 0,1 моль/л КCl, 50 ммоль/л трис-НСl (рН 7,5 при 4°С), 1 ммоль/л раствор MgCl2.
2. 2 % раствор сывороточного альбумина.
Ход работы: Крысу декапитируют, мышцы задних конечностей быстро вырезают и помещают в стакан с охлажденной средой выделения. Через 5 мин мышцы переносят в чашку Петри, освобождают от жира, сухожилий и нервов, обсушивают фильтровальной бумагой и тщательно измельчают. К 1 г измельченной ткани добавляют 4 мл среды выделения и гомогенизируют смесь в течение 1 мин. Гомогенат центрифугируют 7 мин при 600 g (4 °С).
|
|
|
Осадок, содержащий обломки клеток, ядра и миофибриллы, отбрасывают. Надосадочную жидкость центрифугируют 5 мин при 2000 g для более полного удаления миофибрилл. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют 10 мин при 9000 g.
Поверхность полученного осадка митохондрий дважды ополаскивают 2 мл среды выделения для удаления верхнего рыхлого слоя, содержащего примесь саркоплазматического ретикулума. Внутренние стенки пробирки осторожно подсушивают фильтровальной бумагой. К осадку добавляют среду выделения из расчета 0,2 мл на 1 г ткани. Осадок тщательно ресуспендируют микропипеткой.
4.4. ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ
Реактивы: 1. 0,9 % раствор КCl.
2. 0,3 моль/л раствор сахарозы, содержащий 0,01 моль/л раствор ЭДТА.
Ход работы: Крысу декапитируют, сердце быстро переносят в стакан с ледяным раствором КCl, хорошо промывают, окрашенный кровью раствор сливают. Отмытое сердце переносят на толстый слой фильтровальной бумаги, обсушивают и ножницами удаляют сосуды, соединительную ткань и жир. Желудочек вскрывают, из внутренней полости удаляют сгустки крови. Ткань еще раз прополаскивают ледяным раствором 0,9 % КCl и, обсушив фильтровальной бумагой, помещают в чашку Петри, поставленную на мелко наколотый лед.
|
|
|
Ножницами измельчают 5 г сердечной мышцы до кашицеобразного состояния. Измельченную ткань переносят в гомогенизатор и добавляют 0,3 моль/л раствор сахарозы, содержащий 0,01 моль/л раствор ЭДТА из расчета 10 мл раствора на 1 г сырой массы. Ткань гомогенизируют 1 мин в стеклянном гомогенизаторе со стеклянным пестиком. Гомогенат центрифугируют при 600 g в течение 7 мин. Полученный супернатант центрифугируют 15 мин при 11000 g. Надосадочную жидкость сливают, плотный осадок митохонлрий осторожно растирают стеклянной палочкой в 2 мл раствора сахарозы с ЭДТА до гомогенного состояния. К полученной суспензии добавляют раствор сахарозы с ЭДТА до 40 мл и вновь осаждают митохондрии.
4.5. ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС
Реактивы: 1. 0,25 моль/л раствор сахарозы.
2. 0,25 моль/л раствор сахарозы, содержащий 0,01 моль/л раствор ЭДТА (среда выделения).
Ход работы: Изолированную печень промывают в охлажденной среде выделения, измельчают ножницами в чашке Петри, стоящей во льду. В гомогенизатор переносят 1 г измельченной ткани, добавляют 9 мл охлажденной среды выделения и гомогенизируют в течение 1 мин.
|
|
|
Гомогенат центрифугируют в течение 10 мин при 600 g для удаления обломков клеток и ядерной фракции. Полученный супернатант центрифугируют при 14000 g в течение 10 мин. Осевшую митохондриальную фракцию суспендируют в 0,25 моль/л растворе сахарозы, не содержащем ЭДТА, и вновь центрифугируют (14000 g, 10 мин). Cупернатант сливают, на полученный осадок митохондрий осторожно наслаивают 0,3 мл 0,25 моль/л раствора сахарозы. Легким движением смывают верхний рыхлый слой осадка.
Процедуру повторяют еще дважды, и полученный плотный осадок митохондрий тщательно суспендируют с помощью пипетки в 0,5 мл 0,25 моль/л раствора сахарозы.
Литература
ОСНОВНАЯ
Алейникова, Т. Л. Руководство к практическим занятиям по биологической химии / Т. Л. Алейникова, Г. В. Рубцова, Н. А. Павлова; под ред. Е. С. Северина. М.: МГУ, 2000.
Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. М.: Медицина, 1990.
Дамбре, А. Химия белка / А. Дамбре. М.: Мир, 1990.
Кушманова, О. Д. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии / О. Д. Кушманова, Г. М. Ивченко. М.: Медицина, 1983.
|
|
|
Ленинджер, А. Основы биохимии: в 3 т. / А. Ленинджер. М.: Мир, 1985.
Мешкова, Н. П. Физико-химические методы исследования в биологии / Н. П. Мешкова. М.: МГУ, 1975.
Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Остерман. М.: Мир, 1985.
Практикум по биохимии / под ред. С. Е. Северина, Г. А. Соловьевой. М.: МГУ, 1989.
Программы по биологическим дисциплинам. М.: БГУ, 2000.
Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М.: Мир, 1985.
Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии / Ю. Б. Филиппович. М.: Просвещение, 1999.
Чиркин, А. А. Практикум по биохимии / А. А. Чиркин. Минск: Новое знание, 2002.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ
Гааль, Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи. М.: Мир, 1982.
Детерман, Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. М.: Мир, 1970.
Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки / Т. Дэвени, Я. Гергей. М.: Мир, 1976.
Жидкостная колоночная хроматография / под ред. З. Дейла, К. Мацека, Я. Янака. М.: Мир, 1978.
Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам / под ред. О. Микеша. М.: Мир, 1982.
Методы практической биохимии / под ред. Б. Уильямса, К. Уилсона. М.: Мир, 1978.
Фрайфелдер, Д. Физическая биохимия / Д. Фрайфелдер. М.: Просвещение, 1980.
Хроматография. Практическое приложение метода / под ред. Э. Хефтмана. М.: Просвещение, 1986.
Электромиграционные методы / под ред. О. Микеша. М.: Мир, 1982.
Электрофоретические методы анализа белков / под ред. Р. К. Саляева, П. Д. Решетова. Новосибирск, 1981.
Якубке, X . Д. Аминокислоты, пептиды и белки / X. Д. Якубке, X. М. Ешкайт. М.: Мир, 1985.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ В ИНТЕРНЕТЕ
Научные издания по биохимии, химии и смежным наукам www.chemport.org.
Сайт Белгосуниверситета www.bsu.by, сайт Московского государственного университета (включая доступ в библиотеку) www.msu.ru.
Учебники, научные монографии, обзоры, лабораторные практикумы на сайте практической молекулярной биологии www.molbiol.ru, на сайте www.nature.ru.
СОДЕРЖАНИЕ
| Предисловие …………………………………………………………….. | 3 |
| 1. Количественное определение белка в биологическом материале ………………………………………………………………... | 5 |
| 1.1 Биуретовый метод…………………………………………………… | 5 |
| 1.2 Метод Бенедикта ……………………………………………………. | 6 |
| 1.3 Метод Лоури………………………………………………………… | 7 |
| 1.4 Метод Петерсона ……………………………………………………. | 8 |
| 1.5 Определение с кумасси синим……………………………………… | 9 |
| 1.6 Спектрофотометрический метод…………………………………… | 9 |
| 2. Фракционирование белков…………………………………………. | 11 |
| 2.1 Электрофоретическое разделение белков…………………………. | 11 |
| 2.2 Разделение белков методом хроматографии……………………… | 23 |
| 3. Определение молекулярной массы белков……………………… | 34 |
| 3.1 Метод гель-хроматографии на колонках………………………… | 34 |
| 3.2 Гель-хроматография в тонком слое сефадекса…………………… | 35 |
| 3.3 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия………………………………………………… | 38 |
| 4. Подготовка биологического материала …………………………. | 43 |
| 4.1 Получение сыворотки крови ………………………………………. | 43 |
| 4.2 Выделение плазматических мембран печени крыс ……………… | 43 |
| 4.3 Выделение митохондрий скелетных мышц ……………………… | 43 |
| 4.4 Выделение митохондрий сердечной мышцы…………………….. | 44 |
| 4.5 Выделение митохондрий печени крыс ……………………………. | 45 |
| Литература………………………………………………………………. | 46 |
Учебное издание
БИОХИМИЯ БЕЛКОВ
Практикум
Для студентов биологического
Факультета специальности
Биология»
Дата добавления: 2019-02-26; просмотров: 287; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!