Вертикальный электрофорез в пластине
Электрофорез белков в пластине полиакриламидного геля имеет ряд преимуществ по сравнению с электрофорезом в трубочках: 1) процесс менее длителен; 2) метод позволяет в абсолютно идентичных условиях проводить одновременное разделение 10 – 13 проб белка; 3) в зависимости от используемого красителя, а также от природы белка на пластине полиакриламида удается обнаружить от 5 до 50 мкг белка.
Ход работы. В пластиковую рамку ячейки-кассеты, представленной на рис. 3, вставляют два стекла. Ячейку герметизируют с помощью специальных прокладок из силиконовой резины. В зазор между стеклами заливают смесь для полимеризации. Если разделение проводят в геле только одного типа, раствор заливают в кассету доверху и сразу же между стеклами вставляют специальную пластинку – так называемую «гребенку». Ее зубцы образуют углубления на поверхности геля, в которые затем вносят образцы белка.
Если в работе используют два типа гелей (концентрирующий и разделяющий), то первоначально в кассету на высоту 85 – 95 мм от дна заливают раствор для полимеризации разделяющего геля. На него осторожно наслаивают дистиллированную воду и кассету оставляют в вертикальном положении до полимеризации геля. После окончания полимеризации воду удаляют фильтровальной бумагой, а на поверхность разделяющего геля наносят смесь для полимеризации концентрирующего геля до полного заполнения кассеты и вставляют гребенку.
|
|
|
После окончания полимеризации удаляют одну из герметизирующих прокладок, гребенку вынимают, а ячейку вставляют в прибор. После сборки прибора электродные камеры заполняют буферным раствором, а в лунки на поверхности геля микропипеткой наносят 50 мкл белкового образца, приготовленного на 10 % растворе сахарозы. После нанесения образца прибор подключают к источнику тока и проводят электрофорез.
После того как маркерный краситель, вносимый с образцом белка, достигнет нижней границы пластины, источник питания выключают, сливают электродные буферы и вынимают гелевую ячейку. Из ячейки вынимают уплотнительные прокладки, аккуратно отделяют одно стекло от другого и переносят пластину геля в плоскую кювету или пластмассовую коробку. Для фиксации, прокраски и обесцвечивания используют те же растворы, что и в случае цилиндрических гелей. Время прокраски уменьшают в два раза.
2.1.3. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ
Агаровый гель является очень мягким носителем, при нем не происходит инактивации белков, что позволяет определять активность отдельных фракций белков непосредственно в геле после проведения электрофореза. Приготовление агарового геля значительно проще, чем крахмального или полиакриламидного, продолжительность электрофореза составляет не более 4 ч.
|
|
|
Реактивы. 1. Мединал-вероналовый буфер (рН 8,6): в 500 мл воды растворяют 17,52 г мединала, добавляют 2,76 г веронала и, помешивая, нагревают на теплой водяной бане до растворения веронала. Затем раствор доводят дистиллированной водой до 1 л.
2. 1 % раствор агара.
3. 0,1 % раствор амидового черного 10 Б в 2 % растворе CH3COOH.
4. 5 % раствор CH3COOH.
Ход работы. Для приготовления агаровых пластинок используют предметные стекла, которые обезжиривают, тщательно промывают водой и высушивают. Стекла нумеруют, укладывают на строго горизонтальную поверхность и на каждое осторожно наливают пипеткой с широким концом 4 мл агара. Пузырьки воздуха в агаре необходимо вывести пипеткой на края стекла.
Когда агар застынет и образуется твердый гель, в нем посередине вырезают лунку для нанесения исследуемого раствора. Приготовленные пластинки укладывают в электрофоретическую камеру.
Агаровое плато соединяют с буферным раствором полосками фильтровальной бумаги. В лунку каждой пластинки вносят 10 мкл исследуемого образца (200 мкг белка).
Прибор подключают к источнику тока. Медленно повышая напряжение, доводят силу тока до 20 -25 мА (напряжение 200 – 300 В). Электрофорез проводят в течение 3 – 4 ч.
|
|
|
После окончания электрофореза предметные стекла с агаровым гелем извлекают из камеры и помещают на 30 мин в 5 % раствор CH3COOH. Каждую пластинку покрывают листочком фильтровальной бумаги, смоченным в 5 % растворе CH3COOH, и высушивают при комнатной температуре в течение ночи. Фильтровальную бумагу осторожно снимают.
Окрашивание белков на электрофореграммах проводят амидовым черным 10 Б в течение ночи. Не связавшийся с белком краситель отмывают 5 % раствором уксусной кислоты. Отмытые электрофореграммы высушивают при 37 ºС.
2.1.4. АНАЛИТИЧЕСКОЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ БЕЛКОВ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Принцип метода. Если на колонку, вдоль длины которой сформирован градиент рН, нанести образец, а потом подключить концы колонки к источнику тока, то молекулы белка будут двигаться по колонке до тех пор, пока не достигнут той области, где величина рН окажется равной величине изоэлектрической точки белка. Для создания градиента рН используются сложные смеси амфотерных соединений, названия которых различаются в зависимости от фирмы-изготовителя (например, амфолины, фармалиты, сервалиты).
|
|
|
Величина рК амфолитов варьирует от 2,5 до 11. Изоэлектрические точки некоторых из них отличаются друг от друга не более чем на 0,05 единиц рН. Смесь амфолитов помещают в колонку, заполненную крупнопористым гелем или концентрированным раствором сахарозы. Один конец колонки погружают в разбавленный раствор щелочи, куда опускается один электрод (катод), а другой конец колонки помещают в разбавленный раствор кислоты, куда опускается другой электрод (анод). При подключении электрического тока амфолиты, имеющие изоэлектрические точки при кислых значениях рН и располагающиеся у катода, депротонируются, приобретают большой отрицательный заряд и начинают двигаться к аноду. В то же время амфолиты, расположенные около анода и имеющие изоэлектрические точки при щелочных значениях рН, протонируются, приобретают положительный заряд и движутся к каноду.
Значения рН используемых растворов щелочи и кислоты соответственно выше и ниже величин рI самых «щелочных» и самых «кислых» амфолитов. Вследствие этого по мере приближения к электродам все амфолиты проходят такую область геля, где рН оказывается равным изоэлектрической точке амфолитов. В этой области суммарный заряд амфолитов становится равным нулю и они перестают передвигаться к электродам.
Накопление амфолитов, обладающих одним и тем же рI, в одной зоне приводит к созданию мощного буфера, способного поддерживать рН, равный изоэлектрической точке этой группы амфолитов. После того как все амфолиты достигнут соответствующих областей, на геле создается устойчивый градиент рН, крутизна, форма и стабильность которого определяются концентрацией и диапазоном рI используемых амфолитов, а также составом и концентрацией приэлектродных растворов. Если формирование градиента рН происходит в присутствии белка, суммарный заряд молекулы которого определяется соотношением кислых и щелочных аминокислот, или если белок наносят на уже сформированный градиент рН, то молекулы белка ведут себя так же, как и молекулы амфолитов. Вследствие этого после окончания процесса изоэлектрофокусирования белки концентрируются в виде очень узких зон, положение которых определяется изоэлектрической точкой белка.
Реактивы: 1. Раствор для приготовления геля. Акриламид (24 г) и метиленбисакриламид (1 г) растворяют в воде и доводят объем до 100 мл. Раствор хранят в темной склянке на холоду.
Внимание! Работу с акриламидом проводят под тягой, в перчатках!
2. 40 % раствор амфолитов.
3. 40 % раствор персульфата аммония.
4. 10 % раствор ТЕМЕД.
5. 40 % раствор сахарозы.
6. 0,5 моль/л раствор NaOH.
7. 0,5 моль/л раствор H3PO4.
8. 0,075 % раствор Кумасси G-250 в 3,5 % растворе HClO4.
9. Белки с известными изоэлектрическими точками: сывороточный альбумин (рI 4,6), овальбумин (рI 4,6), каталаза (рI 5,7), гемоглобин (рI 6,8 – 7,0), РНКаза (рI 7,8), α-химотрипсин (рI 8,1), папаин (рI 9,0), лизоцим (рI 10,5), цитохром с (рI 10,0).
10. Красители с известными изоэлектрическими точками: патентованный синий V (рI 3,0), малахитовый зеленый FCF (рI 3,05 и рI 3,85), метиловый синий (рI 3,6), конго красный (рI 5,8).
Ход работы: Для приготовления 2 мл геля, достаточного для заполнения одной трубки при электрофокусировании, смешивают 0,4 мл реактива 1; 0,1 мл 40 % раствора амфолитов широкого диапазона рН (рН 3 – 9 или рН 2 – 11); 0,5 мл раствора сахарозы и 0,9 мл воды. Смесь деаэрируют в течение 10 мин. После этого в смесь добавляют 0,1 мл (1 мг/мл) раствора исследуемого белка или белка с известной изоэлектрической точкой (реактив 9). В качестве стандартов с известными изоэлектрическими точками можно использовать красители (реактив 10). В этом случае вместо белка в образец вносят 0,1 мл водного раствора красителя с концентрацией 0,05 мг/мл.
К 2 мл полученного раствора добавляют 10 мкл раствора ТЕМЕД и 2 мкл раствора персульфата аммония. Полученную смесь немедленно заливают в трубочки с внутренним диаметром 3 -5 мм и длиной 8 – 10 см, установленные в специальной подставке. Сверху на этот раствор осторожно наслаивают воду.
После окончания полимеризации трубочки вставляют в верхнюю электродную камеру прибора для электрофореза (см. рис.3). Для предотвращения выскальзывания геля из трубочки ее нижний конец закрывают целлофановой мембраной, которую закрепляют на трубке с помощью резинового кольца.
В верхнюю камеру прибора заливают 0,5 моль/л раствор NaOH, в нижнюю камеру – 0,5 моль/л раствор H3PO4. Вставляют электроды так, чтобы в верхнем сосуде располагался катод, а в нижнем – анод, и подключают к источнику питания. Величина силы тока на каждую трубку должна составлять 1 мА.
По мере фокусирования из-за возрастания сопротивления напряжение увеличивают до 250 – 300 В, после чего источник питания переключают в режим стабилизации напряжения и поддерживают его равным 300 В в течение 3 – 5 ч. Об окончании фокусирования судят по миграции и концентрированию зон красителей с известными изоэлектрическими точками или по движению зон окрашенных белков (цитохром с, гемоглобин, каталаза).
После окончания электрофокусирования гели извлекают из трубок. Часть гелей прокрашивают для выявления белковых зон, а один или два используют для измерения градиента рН, сформированного в ходе изоэлектрофокусирования.
Для окрашивания гели погружают на 1 ч в 0,075 % раствор Кумасси G-250 в 3,5 % растворе HClO4. Затем гели 5 раз промывают 3,5 % раствором HClO4. Белки выявляются в виде синих полос на слабо-желтом фоне.
Для определения рН гель разрезают поперек на диски толщиной 4 мм. Эти диски помещают в пробирки и заливают минимальным объемом (2 мл) бидистиллированной воды. Пробирки продувают инертным газом, закрывают пробками со шлифом и оставляют при комнатной температуре на 10 – 12 ч. За это время амфолиты диффундируют из геля, поэтому, измерив рН в каждой пробирке, можно определить градиент рН на геле. Зная градиент рН и положение белка на геле, определяют изоэлектрическую точку исследуемого белка.
Дата добавления: 2019-02-26; просмотров: 541; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!