ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ
Методы определения молекулярной массы белка можно разделить на химические, физико-химические и физические. К наиболее распространенным физико-химическим методам определения молекулярной массы белков относятся гель-хроматография (на колонках и в тонком слое), а также электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Использование этих методов не требует сложной аппаратуры и большого количества исследуемого материала.
МЕТОД ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИИ НА КОЛОНКАХ
Принцип метода. Метод основан на том, что для большого числа глобулярных белков имеется линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы и объемом элюирования с колонки, заполненной гелем с определенной величиной пор. Поэтому для определения молекулярной массы глобулярного белка достаточно определить объем его элюции с предварительно откалиброванной колонки. Калибровку колонки проводят, пропуская через нее белки с известной молекулярной массой и определяя объемы элюции для каждого из них.
Для сефадекса G-75 экспериментальным путем получено уравнение для расчета молекулярной массы:
lg M = 5,624 – 0,752 · (Vэ / Vo),
где М – молекулярная масса; Vэ – объем раствора, в котором из колонки выходит исследуемое вещество; Vo – свободный объем колонки.
Реактивы: 1. 1 % раствор голубого декстрана.
2. 0,1 моль/л раствор NaCl.
3. Сефадекс G-75 – 4 г.
|
|
|
4. 1 % раствор гемоглобина.
Ход работы.Подготовку колонки проводят аналогично тому, как это описано для метода гель-хроматографии. После заполнения колонки гелем сефадекса G-75 ее промывают 0,1 моль/л раствором NaCl.
Открывают зажим на колонке и сливают 0,1 моль/л раствором NaCl, находящийся над гелем. Зажим закрывают и на поверхность геля аккуратно наносят 0,5 мл раствора голубого декстрана. Открывают зажим и собирают вытекающую из колонки жидкость в мерный цилиндр, сохраняя ее до конца опыта.
Как только из колонки начнет вытекать окрашенный (голубой) раствор, начинают сбор элюата в заранее подготовленные пробирки по 20 капель в каждую пробирку. Элюат из этих пробирок от начала ряда, включая пробирку с самой интенсивной окраской, сливают в мерный цилиндр, где уже собраны предыдущие (неокрашенные) фракции. Объем остальных пробирок, в которых окраска начинает ослабевать, не учитывается. Таким образом, объем элюата от начала опыта до появления наиболее яркой голубой окраской составляет свободный объем колонки (Vo).
Закончив определение свободного объема, колонку отмывают от следов голубого декстрана. После этого в колонку вносят 0,5 мл 1 % раствора гемоглобина и повторяют ход работы, описанный для голубого декстрана. Объем элюата от начала эксперимента с гемоглобином до появления в пробирке максимально розовой окраски определяют как Vэ.
|
|
|
Полученные значения Vo и Vэ подставляют в приведенное выше уравнение и находят молекулярную массу, используя таблицу логарифмов.
ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ В ТОНКОМ СЛОЕ СЕФАДЕКСА
Принцип метода. По мере продвижения раствора по пластинке с нанесенным на нее тонким слоем геля сефадекса смесь белков распределяется в нем таким образом, что расстояние, пройденное каждым белком от линии старта, пропорционально логарифму его молекулярной массы. Построив калибровочный график зависимости расстояния, пройденного белками-маркерами, от логарифма их молекулярной массы и определив длину пути, пройденного исследуемым белком, можно определить его молекулярную массу.
Оборудование: 1. Столик с переменным углом наклона (рис. 6).
2. Хроматографическая камера.
 |
Рис. 6 – Оборудование для хроматографического разделения белков в тонком слое сефадекса:
а – столик с переменным углом наклона; б – хроматографическая камера (1, 3 – отсеки, заполненные буферным раствором; 2 – отсек, в который помещают стеклянную пластинку), 4 – стеклянная пластинка, покрытая гелем сефадекса; 5 – соединительные мостики из фильтровальной бумаги; в – скользящая крышка
|
|
|
Реактивы: 1.Сефадекс G-200 или G-150.
2. 0,1 моль/л натрий-фосфатный буфер, pH 7,4.
3.0,1 % раствор бромфенолового синего, приготовленного на смеси этанол : концентрированная уксусная кислота (9:1).
4. 5 % раствор СН3СООН.
5. 2 % раствор СН3СООNa, приготовленный на 10 % растворе СН3СООН.
6. Набор белков-маркеров с известной молекулярной массой: сывороточный альбумин (70 000 Да), рибонуклеаза (12 700 Да), яичный альбумин (45 000 Да), трипсин (23 800 Да), креатинкиназа из мышц кролика (80 000 Да), глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (144 000 Да), пируваткиназа (237 000 Да).
7. Хроматографическая бумага.
Ход работы. 4 г сухого сефадекса суспендируют в избытке натрий-фосфатного буфера и оставляют набухать в течение 3 сут при комнатной температуре или в течение нескольких часов при 60 °С. Перед нанесением на стеклянную пластинку (20 × 40 см), которая должна быть вымыта с особой тщательностью, избыток буфера над гелем декантируют, а гель перемешивают и наносят фарфоровой ложкой на пластинку, расположенную на столике со строго горизонтальной поверхностью. Слой геля распределяют по пластинке стеклянной палочкой размером 1 × 22 см с надетой на концы резиновой трубкой, прокатывая палочку вдоль пластинки несколько раз для получения равномерного слоя геля толщиной 1 мм (без комочков и пузырьков воздуха). Пластинку подсушивают на воздухе в течение 15 мин, а затем помещают в средний отсек камеры, как показано на рис. 6.
|
|
|
Крайние резервуары заливают 0,1 моль/л фосфатным буфером (pH 7,4), слой геля соединяют с буферным раствором полосками хроматографической бумаги, камеру закрывают скользящей крышкой и помещают на подставку с переменным углом. Угол наклона камеры устанавливают равным 7 – 10°. Камеру оставляют для насыщения на ночь при комнатной температуре.
Убедившись в равномерности слоя сефадекса, наносят микропипеткой по 0,02 мл растворов (5 мг/мл) исследуемого белка и белков-свидетелей. Для этого пластинку устанавливают горизонтально и наносят белки в отдельные точки на расстоянии 3 см от верхнего края пластинки и друг от друга. Закрывают камеру крышкой и устанавливают ее под углом 7 – 10°. Гель-хроматографию проводят в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем камеру устанавливают горизонтально, полоски хроматографической бумаги удаляют, пластинку помещают на горизонтальную подставку и снимают “реплику” на хроматографическую бумагу. Для этого бумагу свертывают в трубочку и, постепенно разворачивая, накладывают на тонкий слой так, чтобы бумага прилипла к нему. Не следует сильно надавливать на бумагу, чтобы не повредить слой сефадекса. Бумагу оставляют на пластинке 1 мин, затем высушивают при 90 °С в течение 20 мин и помещают в кювету для окрашивания.
Для идентификации белковых зон “ реплику ” помещают на 3 – 5 мин в раствор бромфенолового синего; краситель отмывают дважды 5 % раствором СН3СООН и закрепляют 2 % раствором уксуснокислого натрия, приготовленного на 10 % растворе СН3СООН.
После тщательного промывания в холодной проточной воде хроматографическую бумагу высушивают и измеряют расстояние, пройденное каждым белком от точки нанесения до центра белкового пятна. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс величину отношения lа : lст (lа – длина пути, пройденного данным белком; lст – расстояние, пройденное стандартным белком, например сывороточным альбумином), по оси ординат – логарифм молекулярной массы данного белка. Определив расстояние белковой зоны исследуемого белка от старта, по калибровочному графику находят его молекулярную массу.
3.3. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА НАТРИЯ
Принцип метода. Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсульфата натрия в присутствии β-меркаптоэтанола, распадаются на отдельные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофореграммах таким образом, что подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы. Метод дает возможность определять молекулярные массы субъединиц олигомерных белков. Электрофоретическое разделение можно проводить различными методами. Ниже описаны два из них: метод Вебера и Осборн, а также метод, предложенный Лэммли.
В методе Вебера и Осборн буферные растворы для приготовления геля и электродный не отличаются между собой. Обычно используют 0,1 или 0,05 моль/л натрий-фосфатный буфер. В методе Лэммли гелевый и электродный буферные растворы отличаются друг от друга по составу и величине pH. Кроме того, используют два типа гелей –концентрирующий и разделяющий. Эти модификации приводят к тому, что на границе между концентрирующим и разделяющим гелем весь белковый образец собирается в виде узкого диска. Это способствует более четкому разделению белков.
3.3.1. МЕТОД ВЕБЕРА И ОСБОРН
Реактивы: 1. 30 % раствор акриламида, содержащий 0,6 % раствор метиленбисакриламида.
Внимание! Работу с акриламидом проводят под тягой, в перчатках!
2. Буфер для приготовления геля: 0,2 моль/л натрий-фосфатный буфер (pH 7,2).
3. Буфер для приготовления образцов: 0,02 моль/л натрий-фосфатный буфер (pH 7,2).
4. Электродный буфер: 0,05 моль/л натрий-фосфатный буфер (pH 7,2).
5. Раствор персульфата аммония – 15 мг/мл (готовят непосредственно перед употреблением).
6. ТЕМЕД.
7. 40 % раствор сахарозы.
8. 70 % раствор изопропилового спирта.
9. 0,04 % раствор кумасси R-250, приготовленный на 20 % растворе изопропанола и 10 % растворе СН3СООН.
10. 10 % раствор уксусной кислоты.
11. 10 % раствор додецилсульфата натрия (ДСН).
12. β-меркаптоэтанол.
13. Набор белков-маркеров с известной молекулярной массой. В качестве белков-маркеров можно использовать следующие белки: фосфорилаза (91 000 Да), бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да), химотрипсиноген А (27 000 Да), РНКаза (14 000 Да), цитохром с (12 000 Да) – 5 мг/мл.
Ход работы. В растворы опытных и стандартных белков, содержащие 5 мг/мл, добавляют 10 % раствор ДСН до конечной концентрации 1 % и β-меркаптоэтанол (для предотвращения неспецифической агрегации полипептидных цепей) до конечной концентрация 3 %. Образцы выдерживают 5 мин при температуре 90° С. Если опытные или стандартные образцы находятся в растворах, содержащих ионы К+ или NН4+, перед обработкой ДСН их нужно обессолить диализом или гель-хроматографией, так как додецилсульфат калия и аммония плохо растворимы в воде.
Готовят гель.Для этогов эрленмейеровскую колбочку сливают 10 мл раствора акриламида, 15 мл фосфатного буфера, содержащего 30 мг ДСН, 3,5 мл Н2О, 1,5 мл персульфата аммония и 0,04 мл ТЕМЕД.
Разделение белка можно проводить как в трубочках, так и на пластинах для вертикального электрофореза. После обработки ДСН к образцам добавляют сахарозу (до концентрации 10 %) и в качестве лидирующего красителя — бромфеноловый синий (до концентрации 0,001 %).
Образцы исследуемых белков и белков-маркеров наносят на поверхность геля в объеме от 20 до 100 мкл (каждого или смеси нескольких образцов) и осторожно наслаивают электродный буфер. Нагрузка на гель определяется методом окраски гелей, а также способностью того или иного белка связывать используемый краситель. Как правило, при электрофорезе в трубочках удается обнаружить от 20 до 100 мкг белка, при электрофорезе в пластинке – от 4 до 15 мкг.
В электродный буфер катодного отделения добавляют ДСН до концентрации 0,1 %. Электрофоретическое разделение проводят при комнатной температуре и силе тока 8 мА на трубочку. При этом сначала устанавливают силу тока – 2 мА на трубочку (напряжение около 50 В), напряжение поднимают до 100 – 200 В лишь после того, как образцы войдут в гель. Разделение проводят до тех пор, пока краситель не пройдет 4/5 всей длины геля. Обычно это занимает 4 – 6 ч.
После этого электрофорез прекращают, вынимают гель и помещают его для фиксации в 70 % раствор изопропанола на 1 ч. Затем гели прокрашивают раствором кумасси R-250 в течение 2 ч. Избыток краски удаляют промыванием 10 % раствором СН3СООН.
После окончания отмывки геля проводят обработку электрофореграмм. Определяют расстояние, пройденное каждым белком от стартовой линии. Определение можно проводить визуально или с помощью денситометра при 550 – 600 нм. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс длину пути 1а, пройденного данным белком, а по оси ординат – логарифм его молекулярной массы. Определив длину пути, пройденного белком с неизвестной молекулярной массой 1 x, пользуясь калибровочным графиком, определяют молекулярную массу исследуемого белка. При проведении электрофореза в трубочках часто трудно получить хорошо воспроизводимые результаты на разных трубках. В этом случае определяют не абсолютную, а относительную подвижность белков. Для этого определяют отношение длины пробега белковой зоны либо к общей длине геля, либо к длине пробега лидирующего красителя. После этого строят зависимость относительной подвижности белков от логарифма их молекулярной массы.
МЕТОД ЛЭММЛИ
Реактивы: 1. 30 % раствор акриламида, приготовленного на 0,4 % растворе метиленбисакриламида; 29,6 г акриламида и 0,4 г метиленбисакриламида растворяют в воде и объем раствора доводят до 100 мл.
Внимание! Работу с акриламидом проводят под тягой, в пер чатках!
2. Буфер для приготовления разделяющего геля: 1,5 моль/л трис-НС1 буфер, содержащий 0,4 % раствор ДСН (pH 8,8).
3. Буфер для приготовления концентрирующего геля: 0,5 моль/л трис-НС1 буфер, содержащий 0,4 % раствор ДСН (pH 6,8).
4. Электродный буфер: 0,025 трис-0,192 моль/л глицин (pH 8,6). Необходимую навеску глицина растворяют в воде и добавляют сухой трис до pH 8,6, после чего объем раствора доводят водой до нужной величины. Электродный буфер катодного отделения камеры содержит помимо указанных компонентов ДСН в концентрации 0,1 %.
5. Буфер для приготовления образцов: 0,0625 моль/л трис-НС1 буфер (pH 6,8), 2 % раствор ДСН, 10 % раствор сахарозы (или глицерин), 0,001 % раствор бромфенолового синего. Перед употреблением в указанный раствор добавляют β-меркаптоэтанол до конечной концентрации 5 %.
6. Раствор персульфата аммония – 15 мг/мл.
7. ТЕМЕД.
8. 70 % раствор изопропилового спирта.
9. 10 % раствор уксусной кислоты.
10. 0,04 % раствор кумасси R-250, приготовленного на смеси: изопропанол: этанол: уксусная кислота: вода в соотношении 2:1:1:6.
11. Набор белков-маркеров с известной молекулярной массой. В качестве белков-маркеров можно использовать следующие белки: фосфорилаза (91 000 Да), бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да), химотрипсиноген А (27 000 Да), РНКаза (14 000 Да), цитохром с (12 000 Да) – 5 мг/мл.
Ход работы. Для полимеризации 30 мл разделяющего геля (12,5 %) смешивают 12,5 мл раствора акриламида, 7,5 мл буфера разделяющего геля и 10 мл воды. К смеси добавляют 16 мг персульфата аммония и 18 мкл ТЕМЕД.
Полученный раствор заливают либо в гелевую ячейку для вертикального электрофореза в пластине, либо в трубки. На поверхность раствора наслаивают дистиллированную воду. После полимеризации удаляют воду шприцем или фильтровальной бумагой.
Готовят смесь для концентрирующего геля. Смешивают 4 мл 30 % раствора акриламида с 5 мл буфера концентрирующего геля и добавляют 11 мл воды (суммарный объем 20 мл). К полученной смеси добавляют 15 мг персульфата аммония и 16 мкл ТЕМЕД и наносят на вершину уже заполимеризовавшегося разделяющего геля. Обычно длина концентрирующего геля в 5 – 6 раз меньше длины разделяющего геля. На поверхность полимеризуемых гелей наслаивают воду.
Исследуемые и стандартные белки-маркеры растворяют в буферном растворе для приготовления образцов в концентрации 5 мг/мл и кипятят на водяной бане 5 мин. Электрофорез и обработку электрофореграмм проводят, как описано для метода Вебера и Осборн.
Дата добавления: 2019-02-26; просмотров: 2057; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!