РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ
По механизмам разделения выделяют следующие виды хроматографии: адсорбционную (газовую или жидкостную), осадочную, ионообменную, распределительную, гель-фильтрационную (гель-хроматографию) и биоспецифическую (аффинную); по форме проведения – колоночную, хроматографию на бумаге и в тонком слое. Для фракционирования белков применяется главным образом хроматография на колонках.
МЕТОД ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИИ
Принцип метода. Гель-хроматография (гель-фильтрация) – фракционирование смеси компонентов по размерам молекул путем прохождения их через гели с определенной величиной пор.
Наибольшей скоростью продвижения по колонке обладают компоненты раствора, размеры молекул которых больше пор геля. Такие компоненты не проникают в гранулы гелевой фазы и выходят из колонки первыми. Более мелкие молекулы, способные проникать внутрь геля, непрерывно обмениваются между жидкими фазами внутри и вне геля и продвигаются по колонке значительно медленнее. Находящиеся в растворе самые маленькие частицы (например, неорганические соли) выходят из колонки последними.
Для обессоливания растворов белков и их концентрирования обычно используют сефадексы G-25 и G-50 (грубый или средний). Сефадексы – продукты взаимодействия полисахарида декстрана с эпихлоргидрином. Они устойчивы к органическим растворителям, растворам щелочей и разбавленных кислот (до 0,1 н.). Рабочий диапазон pH составляет 2 – 10. При разделении же смеси белков пользуются сефадексами тонкого или сверхтонкого зернения (G-100, G-250). Чем мельче частицы геля, тем эффективнее происходит разделение.
|
|
|
Реактивы: 1. 0,05 моль/л натрий-фосфатный или калий-фосфатный буферные растворы, содержащие 0,05 моль/л раствор КСl (pH 6,5).
2. Сефадекс G-100.
3. Белки с определенной молекулярной массой (Да): яичный альбумин (45 000), бычий сывороточный альбумин (68 000), рибонуклеаза из поджелудочной железы (12 700), цитохром с (13 000). Навески по 2 мг.
4. Голубой декстран – раствор 1 мг/мл.
Ход работы.Сухой сефадекс суспендируют в 200-кратном объеме воды и оставляют стоять на 48 ч при комнатной температуре для полного набухания.
Колонку (рис. 4) укрепляют на штативе строго вертикально, закрывают нижний кран – зажим (4) и наливают в нее примерно на 1/3 ее объема дистиллированной воды. Энергичными движениями стеклянного поршня (8) освобождают пространство под коллектором фракций диском от пузырьков воздуха. На диск с помощью поршня помещают кружок фильтровальной бумаги, по размерам точно соответствующий внутреннему диаметру колонки. Поршень осторожно вынимают, следя за тем, чтобы в колонку не попали пузырьки воздуха.
|
|
|
Через воронку или по палочке наливают в колонку густую, тщательно взмученную взвесь используемого сорбента так, чтобы жидкость стекала по стенке колонки и не увлекала в свою толщу пузырьков воздуха. Суспензии дают осесть, через несколько минут открывают кран и продолжают наполнение колонки, постепенно подливая следующие порции взвеси. Необходимо следить за тем, чтобы наполнение колонки было равномерным.
Заполнив колонку до нужной высоты (3/4 колонки), закрывают нижний кран – зажим и дают суспензии осесть, не допуская «высыхания» наполнителя в колонке (для этого над верхним слоем сорбента всегда должен находиться слой растворителя). Следят также за тем, чтобы верхний слой наполнителя имел гладкую горизонтальную поверхность. Для уменьшения взмучивания верхнего слоя при внесении в колонку образца над ним иногда помещают кружок фильтровальной бумаги или поролона. Колонку закрывают пробкой с отводом или со стеклянной трубкой и присоединяют к резервуару (5), как показано на рис. 4, содержащему элюирующий раствор.
Для проверки равномерности заполнения через колонку можно пропустить раствор окрашенного белка, например цитохрома с или голубого декстрана. При этом окрашенная зона должна быть компактной и двигаться по колонке параллельно ее основанию.
|
|
|
Смесь белков (по 2 мг каждого) растворяют в буферном растворе в объеме 1 мл и вносят в колонку. Внесение образца в колонку можно производить несколькими способами. Самый простой из них заключается в следующем: жидкость с поверхности наполнителя осторожно удаляют микропипеткой, оставляя слой в 1 – 2 мм; при помощи пипетки осторожно вносят образец и, открыв нижний кран, дают ему впитаться; остатки образца над сорбентом смывают небольшой порцией элюента; после того как он впитается поверхностью наполнителя, добавляют новые порции элюирующего раствора, создавая слой высотой до 5 см.
После нанесения образца колонку соединяют с верхним резервуаром, устанавливают необходимую скорость протекания элюирующего раствора путем изменения рабочего давления и начинают сбор фракций с помощью коллектора.
Вытекающий из колонки буферный раствор собирают в пробирки порциями по 3 мл. Регистрацию объема элюата, прошедшего через колонку, начинают с момента нанесения образца на колонку. Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически при длине волны, соответствующей максимуму его поглощения. Например, оптическую плотность растворов, содержащих рибонуклеазу, определяют при 230 нм, голубой декстран – при 650 нм, цитохром с – при 412 нм, сывороточный альбумин – при 280 нм.
|
|
|
После окончания анализа колонку промывают несколькими объемами буферного раствора. Строят профиль элюирования отдельных белковых фракций. Для этого вычерчивают график, на горизонтальной оси которого откладывают номера пробирок (фракций) или объем прошедшей через колонку жидкости, а на вертикальной оси – величины оптической плотности фракций.
Рис. 4 – Хроматографические колонки упрощенного (а) и усложненного (б) варианта:
1 – стеклянная колонка; 2 – перфорированный диск; 3 – пробка со стеклянной трубкой; 4, 7 – кран-зажим; 5, 9 – верхний резервуар; 6 – буферный раствор над гелем; 8 – стеклянный поршень; 10 – адаптеры; 11 – сетка из нейлона; 12 – капиллярный шланг, соединенный с регистрирующим устройством и (или) коллектором фракций; 13 – сорбент
Дата добавления: 2019-02-26; просмотров: 1249; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!