ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Оборудование. 1. Аппарат для электрофореза в полиакриламидном геле (рис.2, 3).
2. Источник питания
|
|
Рис. 2 – Аппарат для электрофореза в полиакриламидном геле:
1,2 – электродные камеры, 3 – трубки с гелем; 4 – штатив для трубок.
|
|
Рис. 3 – Схема прибора для вертикального электрофореза в пластинках полиакриламидного геля:
а – общий вид прибора; б – поперечное сечение гелевой ячейки-кассеты; 1 – электродные камеры, заполненные буферным раствором; 2 – электроды; 3 – гелевая ячейка-кассета; 4 – стекла, образующие стенки ячейки; 5 – пластина полиакриламидного геля
Реактивы.1.ТЕМЕД (коммерческий препарат).
2. 1 % раствор персульфата аммония.
3. 0,5 % раствор амидового черного 10 Б в 7 % растворе СН3СООН.
4. 0,1 % раствор Кумасси R-250, приготовленный на 7 % растворе СН3СООН.
5. 7 % раствор СН3СООН.
6. 40 % раствор сахарозы.
7. Реактивы для разделения белков с pI < 7,5:
а) Электродный буферный раствор, pH 8,3; 6,0 г триса и 28,8 г глицина растворяют в воде. Объем доводят до 1 л. При использовании в работе основной раствор разбавляют в 10 раз;
б) Буферный раствор для приготовления геля, pH 8,9. К 36,3 г триса добавляют 48 мл 1 н раствора НСl и объем доводят водой до 100 мл;
в) Раствор акриламида: 28 г акриламида и 0,735 г N,N'-метилен-бисакриламида растворяют в 100 мл воды (сначала растворяют метилен-бисакриламид, затем акриламид); раствор стабилен;
|
|
|
г) Бромфеноловый синий: 1 мг красителя растворяют в 100 мл воды.
8. Реактивы для разделения белков с pI > 7,5:
а) Электродный буферный раствор, pH 4,5: 31,2 г β-аланина и 8 мл ледяной уксусной кислоты доводят водой до 100 мл; перед использованием разбавляют в 10 раз;
б) Буферный раствор для приготовления геля, pH 4,3: 48 мл 1 н раствора КОН смешивают с 17,2 мл ледяной уксусной кислоты. Объем раствора доводят водой до 100 мл;
в) Раствор акриламида: 60,0 г акриламида и 0,4 г метиленбисакриламида растворяют в 100 мл воды;
г) 0,1 % раствор метиленового зеленого.
9.Смесь для получения 7 % геля в щелочной буферной системе:смешивают12,5 мл реактива 6 в, 25 мл реактива 6 г, 0,05 мл реактива 1, 10 мл реактива 2. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл.
10. Смесь для получения 15 % геля в кислой буферной системе: 12,5 мл реактива 7в смешивают с 25 мл реактива 7г, 1 мл реактива 1. Объем раствора доводят водой до 50 мл, после чего к нему добавляют 50 мл 0,28 % раствора персульфата аммония.
Электрофорез в трубочках
Ход работы. Для полимеризации геля тщательно вымытые трубочки фиксируют на специальной подставке из оргстекла. Смесь для полимеризации вносят пипеткой в трубочки, укрепленные в подставке, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не попали внутрь полимеризуемого геля. Уровень смеси должен находиться на расстоянии 1,5 см от верхнего края трубочки.
|
|
|
Сверху осторожно наслаивают 0,3 мл дистиллированной воды для образования ровной поверхности геля. По окончании полимеризации наслоенную воду удаляют фильтровальной бумагой. Трубочки снимают с подставки и ввинчивают в отверстия дна верхнего буферного резервуара (см. рис. 2). Верхний резервуар присоединяют к нижнему, предварительно заполненному электродным буферным раствором, следя за тем, чтобы на концах трубочек не было пузырьков воздуха.
На поверхность геля микропипеткой наносят 100 мкл исследуемого раствора белков (от 50 до 250 мкг белка), предварительно смешанного с 40 % раствором сахарозы в соотношении 1:1 для предотвращения смешивания белкового раствора с электродным буфером.
После нанесения образцов белка в трубочки наслаивают электродный буфер, затем заливают буфер в верхний резервуар. При использовании щелочных буферных растворов в них добавляют раствор бромфенолового синего из расчета 0,5 - 1 мл красителя на 500 мл раствора, в случае кислых буферов используют метиленовый зеленый. Краситель маркирует движущийся пограничный слой во время электрофореза.
|
|
|
Аппарат для электрофореза подключают к соответствующим полюсам источника постоянного тока. В первые 5 – 10 мин электрофорез проводят при силе тока 1,5 – 2 мА на трубочку, затем силу тока увеличивают до 4 – 5 мА. Электрофорез заканчивают, когда окрашенная полоса достигнет нижнего конца трубочки. После завершения электрофореза прибор отключают от источника тока, сливают буферный раствор, трубочки вынимают из прибора и с помощью стальной иглы (под слоем воды) или водой, вводимой шприцом между поверхностью геля и стенкой трубочки, выталкивают столбик геля в 7 % раствор уксусной кислоты. Столбики геля помещают в пробирки и добавляют раствор красителя амидового черного 10 Б. Время окрашивания составляет 10 мин. В качестве красителя можно использовать раствор Кумасси R-250. В этом случае прокрашивание проводят в течении 1 ч при комнатной температуре. После окрашивания избыток красителя отмывают 7 % раствором уксусной кислоты, цилиндрики геля сохраняют в растворе кислоты той же концентрации.
Дата добавления: 2019-02-26; просмотров: 587; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!