КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра биохимии
БИОХИМИЯ
БЕЛКОВ
Практикум
для студентов биологического факультета
специальности 1-31 01 01 «Биология»
специализации 1-31 01 01-05 «Биохимия»
МИНСК
2007
УДК 577.124.088.1 (072)
ББК 28.072 в.р.
Б 63
Авторы:
И. В. Семак, Т. Н. Зырянова, О. И. Губич
Рекомендовано Ученым советом
биологического факультета
6 октября 2006 г., протокол № 2
Рецензент
кандидат биологических наук,
доцент Р. А. Желдакова
Биохимия белков: практикум для студентов биол. фак. спец. 1-31 01 01 «Биология» / авт. И. В. Семак, Т. Н. Зырянова, О. И. Губич. – Минск: БГУ, 2007. – 49 с.
Практикум рассматривает методы количественного определения белков в биологическом материале, методы хроматографического и электрофоретического фракционирования белков, а также методы изучения молекулярной массы белков. Предназначен для студентов биологического факультета БГУ.
УДК 577.124.088.1 (072)
ББК 28.072 в.р.
 |
© БГУ, 2007
ПРЕДИСЛОВИЕ
Огромные успехи биохимии в значительной степени обусловлены совершенствованием методик исследования, разработанных для изучения свойств и строения белков, и без преувеличения их можно назвать фундаментом современной биохимии.
|
|
|
Изучение ферментов, структуры белков, рецепторных взаимодействий типа гормон – белок и белок – белок, физиологически активных пептидов, антибиотиков открывает для исследователей огромные перспективы. Современная биотехнология имеет дело с техникой рекомбинантных ДНК, но ее конечной целью является создание специфических белков и пептидов, которые должны быть идентифицированы методами белковой химии. В современной белковой химии широкое применение находят такие методы, как спектрофотометрия, хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование.
Материал настоящего практикума подбирался исходя из конкретных задач, стоящих перед биохимиком в практической работе. После краткого рассмотрения теоретических основ какого-либо раздела дается описание конкретных методов.
Пособие состоит их четырех разделов:
1. Количественное определение белка в биологическом материале.
2. Фракционирование белка.
3. Определение молекулярной массы белков.
4. Подготовка биологического материала.
|
|
|
Первый раздел призван помочь студентам освоить колориметрические и спектрофотометрические методы определения белка. Во втором разделе студенты знакомятся с современными методами фракционирования белка, включая электрофоретические и хроматографические методы, метод изоэлектрофокусирования. В третий раздел включены методы определения молекулярной массы белков посредством гель-хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле. Четвертый раздел знакомит студентов с наиболее используемыми методами подготовки биологического материала к последующему анализу.
Приведенные в практикуме методики максимально используют доступное лабораторное оборудование и реактивы. Описание методов сопровождается иллюстрациями, изображающими используемую аппаратуру. Это поможет студентам быстрее разобраться в сути предлагаемой методики. Уровень приводимых методических приемов соответствует требованиям современной науки.
Практикум будет способствовать самостоятельной подготовке студентов по различным общим и специальным курсам, развитию их творческой активности, повышению уровня и качества подготовки современных специалистов-биологов. Практикум может быть рекомендован магистрантам, аспирантам, специализирующимся в области биохимии и биотехнологии, а также научным сотрудникам.
|
|
|
Все замечания и пожелания, касающиеся улучшения представленного в практикуме материала, будут приняты авторами с благодарностью.
Белки, или протеины, – этовысокомолекулярные, нелинейные, нерегулярные, неразветвленные природные полимеры, построенные из α-аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки могут состоять из одной или нескольких полипептидных цепей, связанных между собой как ковалентно, так и нековалентно. В состав белков входят 20 генетически кодируемых аминокислот. В некоторых белках, помимо основных, обнаруживается не менее 50 минорных аминокислот. Для анализа белков и пептидов применяется весь арсенал современных физико-химических методов исследования: спектральных, электрофоретических и хроматографических.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
Как при выделении и очистке белков, так и при проведении разнообразных биохимических исследований необходимо количественное определение содержания белка в исследуемой фракции, в выделенном или исследуемом образце. Кроме того, анализ содержания белков в биологических жидкостях (крови) имеет важное биомедицинское значение и используется в диагностических целях. Количественное определение белка проводится, как правило, с небольшим количеством материала и требует высокочувствительных методов детекции.
|
|
|
Наиболее широко распространены колориметрические и спектрофотометрические методы количественного определения белка.
БИУРЕТОВЫЙ МЕТОД
Принцип метода. Метод основан на способности белков давать с раствором сернокислой меди фиолетовое окрашивание в щелочной среде. Для биуретовой реакции необходимо наличие двух ОН-групп и трех атомов азота, находящихся в полипептидной цепи. Группа, образующая пептидную связь (– ОС – NH –) в щелочной среде, присутствует в своей таутомерной форме. В избытке щелочи происходит диссоциация водорода енольной ОН-группы, при этом возникает отрицательный заряд, с помощью которого кислород, взаимодействуя с медью, образует соль; кроме того, медь образует дополнительные (дативные) связи с атомами азота пептидных связей. Возникший комплекс характеризуется высокой стабильностью.
Чувствительность данного метода позволяет определять белок в диапазоне концентраций от 2 до 10 мг в пробе.
Реактивы: 1.Раствор сывороточного альбумина, содержащий 10 мг белка в 1 мл (стандартный раствор).
2. Биуретовый реактив: 0,15 г СuSО4∙5Н2О и 0,6 г натрий-калия виннокислого (NаКС4Н4О6·4Н2О) растворяют в 50 мл Н2О, при энергичном перемешивании приливают 30 мл 10 % раствора NаОН, затем добавляют 0,1 г КI. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл. Реактив хранят в парафинированной или полиэтиленовой склянке в течение 1 мес.
Ход работы.Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовят растворы белка, содержащие 2, 4, 6, 8 и 10 мг альбумина в 1 мл. В каждую пробирку, содержащую 1 мл раствора белка соответствующего разведения добавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность раствора на ФЭК при 540 нм в 1 см кювете.
На каждую точку проводят два определения, для построения калибровочного графика используют среднее арифметическое.
Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику.
МЕТОД БЕНЕДИКТА
Принцип метода.Метод Бенедиктааналогичен биуретовому методу, однако позволяет определять белок в диапазоне концентраций от 0,1 до 2 мг в пробе.
Реактивы. 1. Раствор сывороточного альбумина, содержащий 2 мг белка в 1 мл (стандартный раствор).
2. Реактив Бенедикта: 17,3 г цитрата натрия и 10 г Nа2СО3 растворяют при подогревании в 40 мл дистиллированной воды. В раствор добавляют 1,73 г сульфата меди, растворенного в 10 мл воды. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл.
3. 3 % раствор NаОН.
Ход работы. Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовят растворы белка, содержащие 0,2; 0,6; 1; 1,4; и 2 мг альбумина в 1 мл. К 1 мл раствора, содержащего 0,2–2 мг белка, добавляют 3 мл 3 % раствора NаОН и 0,2 мл реактива Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин определяют оптическую плотность на СФ или ФЭК при 330 нм в 1 см кювете.
На каждую точку проводят два определения, для построения калибровочного графика используют среднее арифметическое.
Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику.
МЕТОД ЛОУРИ
Принцип метода. Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью и позволяет определять содержание белка в диапазоне концентраций от 10 до 100 мкг на пробу.
Многие широко используемые биохимические реагенты мешают количественному определению белка по методу Лоури, усиливая фон или нивелируя окраску с белком. К их числу относятся тирозин, триптофан, фенольные соединения, буферы (трис, хепес, глицин, гистидин, цитрат), сахара (глицерин, сахароза, глюкоза), вещества, применяемые для создания градиента (фиколл, метризамид, поливинилпирролидон), тиольные соединения, восстановители, ЭДТА, тритон Х-100, (NH4)2SO4. В связи с этим при измерении белка в пробах с неизвестной концентрацией контрольная проба должна содержать все компоненты опытной.
Реактивы. 1. Раствор сывороточного альбумина, содержащий 100 мкг белка в 1 мл (стандартный раствор).
2. 2 % раствор Nа2СО3 в 0,1 н растворе NаОН.
3. 0,5 % раствор СuSО4 · 5Н2О в 1% растворе цитрата натрия.
4. Рабочий раствор: 1 мл реактива 3 в день определения смешивают с 50 мл реактива 2.
5. 1 н реактив Фолина – Чокальтеу.
6. 1 н раствор NаОН.
Ход работы. Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовят растворы белка, содержащие 10, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг альбумина в 1 мл. К 1 мл исследуемого раствора, содержащего 10 – 100 мкг белка, приливают 2,0 мл рабочего раствора (4), перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем в пробирку с реакционной смесью добавляют 0,2 мл реактива Фолина – Чокальтеу, тщательно перемешивают и через 30 мин определяют оптическую плотность раствора при 750 нм.
Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику.
МЕТОД ПЕТЕРСОНА
Принцип метода. Данный метод аналогичен методу Лоури, характеризуется высокой чувствительностью (10 – 100 мкг белка), позволяет эффективно определять белок в мембранных фракциях.
Реактивы. 1.Раствор сывороточного альбумина, содержащий 100 мкг белка в 1 мл (стандартный раствор).
2. СТС реактив: 0,1 % раствор СuSО4 · 5Н2О, 0,2 % раствор натрия-калия виннокислого, 10 % раствор Nа2СО3. Натрий-калий виннокислый растворяют в 25 мл дистиллированной воды. Nа2СО3 растворяют в 25 мл дистиллированной воды, к раствору добавляют навеску СuSО4 · 5Н2О и смешивают с раствором натрия-калия виннокислого.
3. 5 % раствор додецилсульфата натрия (SDS).
4. 0,8 моль/л раствор NaOH.
5. 2 н реактив Фолина – Чокальтеу.
6. Реагент А: 1 часть СТС-реактива (1) смешивают с 1 частью 0,8 моль/л раствора NaOH (4), после чего в полученную смесь доливают 2 части 5 % раствора додецилсульфата натрия (3), тщательно перемешивают.
7. Реагент В: 1 часть реактива Фолина – Чокальтеу (5) смешивают с 5 частями дистиллированной воды
Ход работы. Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовят растворы белка, содержащие 10, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг альбумина в 1 мл. К 1 мл исследуемого раствора, содержащего от 10 до 100 мкг белка, приливают 1 мл реагента А (6), перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем в пробирку с реакционной смесью добавляют 0,5 мл реактива В, тщательно перемешивают и через 30 мин определяют оптическую плотность раствора при 670 нм.
Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику.
Дата добавления: 2019-02-26; просмотров: 1340; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!