Иммуноферментный анализ (ИФА)
В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.
Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина.
Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (см. прилож.3, рис.11 и 12).
Сущность ИФА аналогична РИА.
Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.
К преимуществам ИФА следует отнести:
- отсутствие контакта с радиоактивными веществами;
- простота методов оценки реакции;
- стабильность конъюгатов;
- легко поддаётся автоматизации.
Однако по сравнению с РИА отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.
В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:
Конкурентный тип.
Предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определение носительства HBs Ag.
Компоненты:
1) исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;
2) антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;
3) конъюгат – мышиные моноклониальные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой
4) ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат
5) фосфатно – солевой буфер
6) контрольные сыворотки:
|
|
|
- положительная (сыворотка с HBs Ag)
- отрицательная (сыворотка без HBs Ag).
Ход работы.
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.
2) Инкубация 1 час при 370 С
3) Отмывание лунок.
4) Внесение конъюгата
5) Инкубация 1 час при 370 С
6) Отмывание лунок.
7) Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.
Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.
Механизм.
Реакция протекает в три фазы:
1) HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ - АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).
2) Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ-HBs Ag-anti HBs АТ, меченые пероксидазой).
3) ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.
Непрямой тип.
Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ – инфекции.
Цель: Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции – обнаружение антител к антигенам ВИЧ.
Компоненты:
1) исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ)
|
|
|
2) синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки
3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ-м).
4) ОФД
5) фосфатно-солевой буфер
6) контрольные сыворотки:
- положительная
- отрицательная
Ход работы.
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток
2) Инкубация 30 минут при 370 С
3) Отмывание
4) Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом
5) Инкубация 30 минут при 370 С
6) Отмывание
7) Внесение ОФД
Механизм.
Реакция протекает в 3 фазы:
1) Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ ( АГ ВИЧ - АТ к ВИЧ)
2) Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки
3) ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.
Реакция иммуноблотинга (РИ)
РИ разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ. blot – промокать, пятно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления не комплесных антител к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (белки-р24, гликопротеины-gр120, gр 41 и др.). Относятся к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции. Принцип метода (на примере выявления антител к ВИЧ) (см. прилож. 3, рис.13).
|
|
|
Реакция проводится в несколько этапов:
1)Вирус разрушают на компоненты - антигены (р24, gр120, gр 41 и др. ), которые подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, то есть разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.
2)Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигенов. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге. Мембрану разрезают на полоски (стрипы). Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов.
3)Стрипы с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.
4)Стрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают .
5)Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют в зоне локализации комплекса АГ - АТ.
|
|
|
Проточная цитометрия (ПЦ)
В качестве метки используются флюоресцирующие красители (флюоресцеинизотиоцианат, дающее зеленую флюоресценцию, или фикоэритрин,дающее красное свечение).
ПЦ применяется для определения клеток крови, основных популяций лимфоцитов, цитокинов, функциональной активности NK-клеток, активности фагоцитоза, особенностей апоптоза и др.
Образец крови после обработки меченными моноклональными антителами против CD-антигенов клеток пропускают через тонкую трубку. Лазерный луч, пропускаемый через исследуемый образец, возбуждает свечение флюорохрома. Фотоумножитель улавливает и регистрирует флюоресценцию, свидетельствующую о количестве меченных антител, связанных с исследуемой клеткой (см. прилож. 3, рис.14).
Компоненты реакции:
1)исследуемый материал(образец крови);
2)моноклониальные антитела против антигенов (напр., CD4+ , CD8+клеток), меченные флюорохромом;
3)проточный цитометр.
Дата добавления: 2019-01-14; просмотров: 739; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!