Реакция пассивной агглютинации (РПА)
Под РПА понимают реакцию, в которой АТ-а взаимодействуют с высокодисперсными АГ (гаптенами), предварительно адсорбированными на корпускулярных носителях, которые при этом склеиваются.
В качестве корпускулярных носителей применяют эритроциты животных, частицы латекса (полимерные микрошарики), бентонита, сефарозы, клетки St. aureus (штам Cowan-1, содержащий протеин А).
Различают 3 типа РПА:
1) различные варианты РПГА (реакции пассивной гемагглютинации);
2) р. коагглютинации;
3) р. латексагглютинации.
1. РПГА – реакция пассивной гемагглютинации
В основе лежит агглютинация сенсибилизированных эритроцитов. РПГА, как правило, подразумевает использование эритроцитов, сенсибилизированных АТ-ми.
Эритроциты используются нативные и фиксированные (формальдегидом, глутаровым альдегидом, хлоридом хрома и др.).
Ингридиенты реакции РПГА:
1) растворимый (высокодисперсный) АГ (белки, полисахариды и др.);
2) эритроциты (носитель);
3) АТ (испытуемая сыворотка или диагностическая иммунная сыворотка; обычно разводят в соотношении от 1:10 до 1:20480).
4) Изотонический раствор хлорида натрия.
Реакцию инкубируют сначала при 37 0С в течение 2 часов, затем при комнатной температуре в течении 18-24 часов.
При положительной реакции, в результате образования комплекса (АГ-АТ) на поверхности эритроцитов, последние склеиваются и равномерно покрывают все дно пробирки или всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями. При отрицательной реакции скопление эритроцитов имеет вид меленького диска с ровными краями («пуговки») (см. прилож. 3, рис.3).
|
|
|
Ставят контроли специфичности реакции с иммунной антисывороткой (положительная реакция) и нормальной сывороткой (отрицательная реакция).
Контролем спонтанной агглютинации эритроцитов служат реакции со взвесью сенсибилизированных и несенсибилизированных эритроцитов в разведенной нормальной сыворотке.
Недостатки: трудность стандартизации эритроцитов при изготовлении диагностикумов и небольшой срок хранения диагностикумов.
Достоинства: простота и дешевизна.
Эти СР широко применяются. Например, состояние иммунитета против дифтерии у детей и подростков проверяют с помощью РПГА с дифтерийным эритроцитарным диагностикумом (анатоксином). Неиммунными считаются лица с титром антитоксина менее 0,03 МЕ/мл. (1:20).
Необходимые ингредиенты:
1) испытуемая сыворотка;
2) диагностикум дифтерийный эритроцитарный;
3) физиологический раствор;
4) противодифтерийная контрольная сыворотка с активностью 10МЕ/мл;
5) полистероловые пластины (при их отсутствии – пробирки).
Испытуемую сыворотку разводят физ. раствором от 1:10 до 1:20480 в 12 лунках. Реакция ставится в объеме 0,8мл.
|
|
|
Вносят по 1 капле диагностикума в каждую лунку.
Противодифтерийную контольную сыворотку (с активностью 10МЕ/мл) разводят от 1:10 до 1:20480 и вносят также по 1 капле диагностикума.
Оставляют при комнатной температуре на 3 часа (максимум на 15-20 часов) и читают реакцию.
Учет реакции проводят по степени агглютинации эритроцитов, которую оценивают по 4-х кратной системе:
++++ - агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме перевернутый купол; края купола иногда заворачиваются;
+++ - в верхней части агглютината отмечается узкое более широкое плотное кольцо;
++ - в верхней части аглютината более широкое плотное кольцо из эритроцитов, но меньшее по диаметру;
+ - на дне лунки образуется широкое плотное кольцо из эритроцитов, но меньшее по диаметру;
- - на дне лунки имеются плотный диск или плотное широкое кольцо, но уменьшенного диаметра по сравнению с реакцией в +.
Титром антитоксина в исследуемом матариале считают последнее максимальное разведение, которое еще вызывает агглютинацию эритроцитов.
Расчет активности испытуемой сыворотки производят по формуле: Х=(10А)/В, где:
Х – активность испытуемой сыворотки в МЕ/мл.;
|
|
|
10 – титр контрольной сыворотки в МЕ/мл.;
А – максимальное разведение испытуемой сыворотки с полож. Результатом;
В – максимальное разведение контрольной сыворотки с полож. результатом.
2.Реакция коагглютинации, латексаглютинации
Диагностикум представлен стафилококками для коагглютинации и частицыами латекса - для латексреакции, на поверхности которых находятся АТ-ла (см. раздел 3, рис.4).
В случае с фиксированными клетками стафилококка связывание АТ происходит за счет взаимодействия Fс-участками IgС с молекулами протеина А. (раздел 3, рис.4). При получении латексных диагностикумов используют химическое связывание АТ или АГ с полимерной основой частиц или взаимодействие, основанное на гидрофобных силах.
Достоинства: простота постановки.
Недостаток: возможность неспецифической агглютинации.
РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ
Преципитация и агглютинация - это довольно сходные реакции, которые различаются главным образом на основании физических свойств АГ. В первом случае он представлен в растворимой, во втором – в корпускулярной формах. В основе РП лежит образование преципитата в процессе реакции АГ - АТ.
РП высоко специфична и чувствительна.
|
|
|
Ингредиенты реакции:
1. растворимый АГ или гаптен (преципититоген);
2. АТ – преципитины (иммунная преципитирующая сыворотка; получают иммунизацией кроликов соответствующими АГ-ми);
3. изотонический раствор хлорида натрия или агаровый гель.
Методы постановки РП:
1) РП в растворах – р. кольцепреципитации; 2) РП в геле
Реакцию кольцепреципитации ставят в узких преципитационных пробирках, в которые разливают преципитирующие сыворотки. Затем наливают раствор преципитиногена. При положительной реакции на границе соприкосновения ингредиентов появляется мутное кольцо преципитации. Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации используют прокипяченые и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция носит название реакции термопреципитации по Асколи, применяемая для обнаружения термостабильных гаптенов возбудителей сибирской язвы и чумы (см. прилож. 3, рис.6).
.
Одна из разновидностей РП в геле (реакция Оухтерлони) позволяет определять токсигенность дифтерийной палочки с помощью антитоксической сыворотки. В чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой и засевают исследуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги. Инкубируют при 37 0С в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации (см. раздел 3, рис.5).
Реакция преципитации в геле носит название иммунодиффузии. Часто форезом в геле – иммуноэлектрофорез. Принцип метода: исследуемый антиген фракционируют электрофоретически, полученные фракции анализируют методом двойной диффузии при помощи антисыворотки.
Постановка РП по Асколи с целью обнаружения антигена сибиреязвенных бацилл. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:преципитиноген - гаптен B. anthracis (экстракт из тканей), преципитин (преципитирующая сибиреязвенная сыворотка) и физиологический раствор.
Приготовление термопреципитиногена.
1. В колбочку, содержащую 1 г измельчённой кожи или 1 мл культуры B. anthracis налить 10 мл физиологического раствора.
2. Колбу поместить в кипящую баню на 30-45 минут.
3. Профильтровать через асбестную вату. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен.
Для реакции преципитации фильтрат разводится в 100 раз и более.
Постановка реакции кольцепреципитации.
1) В преципитационную пробирку наливается 0,3 мл преципитирующей сыворотки цельной или в разведении 1:5, 1:10.
2) По стенке пробирки осторожно наслаивается преципитиноген.
Реакция считается положительной, если на границе двух жидкостей образуется мутное кольцо выпадающего белка не позднее 5-15 минут (см. прилож. 3, рис.6).
При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли:
а) антиген и физиологический раствор;
б) специфическая сыворотка и физ. раствор;
в) антиген и неспецифическая сыворотка.
Во всех контрольных пробирках помутнения не должно быть. Для реакции преципитации пользуются специальными преципитационными пробирками высотой 40-60 мм и диаметром 4-5 мм, преципитация в узких пробирках наступает значительно скорее и проявляется более чётко, чем в обычных пробирках, их тщательно моют и высушивают, чтобы стекло их было совершенно прозрачным и сухим.
Дата добавления: 2019-01-14; просмотров: 237; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!