МЕЧЕНЫЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
В настоящее время широко применяются серологические реакции, в которых участвуют меченые АГ – ы или АТ – ла. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы, реакция иммуноблотинга, проточная цитометрия и электронная микроскопия.
Они применяются:
1) для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления АТ с помощью набора известных конъюгированных (химически соединённых) с различными метками (ферментами, флюорохромными красителями), антигенов;
2) для определения микроорганизма или его серовара с помощью стандартных меченных диагностических антител (экспресс-диагностика).
Готовят диагностические сыворотки иммунизацией животных соответствующим АГ-м, затем выделяют иммуноглобулины и конъюгируют их со светящимися красителями (флюорохромами), ферментами, радиоизотопами.
Диагностических моноклональных антител получают с помощью гибридных клеток, образованных путем слияния иммунного В-лимфоцита с миеломной клеткой. Гибридомы способны быстро размножаться in vitro в культуре клеток и продуцировать при этом иммуноглобулин, характерный для взятого В-лимфоцита.
Меченые СР по специфичности не уступают другим СР, а по своей чувствительности они превосходят все СР.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
В качестве метки используются светящиеся флюорохромные красители (изотиоционат флюоресцеина и др.).
|
|
|
Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний - для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.
Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.
Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглотки и др.)
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ–АТ, обнаруживают флюоресценцию – свечение.
Компоненты непрямой РИФ:
1) исследуемый материал.
2) специфическая антисыворотка.
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ–ла против иммуноглобулина), меченная флюорохромом
4) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем – меченной антиглобулиновой сывороткой.
Светящиеся комплексы АГ-АТ – меченные АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа (см. раздел 3, рис. 9 и 10).
|
|
|
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.
Также выделяют 4-х компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ - АТ – меченные АТ-комплемент.
Радиоиммунологический анализ (РИА)
В качестве метки используются радиактивные изотопы (131I, 125 I, или 3 H и 14 C).
В зависимости от техники постановки выделяют два способа РИА:
1) техника «жидкая фаза» (классический РИА).
Недостаток этой техники постановки – необходимость специального разделения свободного и связанного меченного антигенов (или антител).
2)техника «твёрдая фаза»
АГ или АТ известной специфичности связываются на сорбентах (твёрдой фазе) – стенках полистироловой лунке или пластиковой пробирки. На иммобилизованный АГ (АТ) последовательно сорбируются остальные компоненты ИК.
В зависимости от характера реакции различают следующие методы:
1) Конкурентный метод – метод, основанный на конкуренции антигенов (определяемого и меченного) за присоединение с адсорбированными на сорбенте антителами или антител (определяемого и меченного) за присоединение с адсорбированными на сорбенте антигенами.
|
|
|
Компоненты реакции:
а) определяемый АГ (исследуемый материал – кровь, мокрота и др.) или АТ (сыворотка крови);
б) идентичный к исследуемому АГ-у антиген или исследуемому АТ-у антитело, меченые радиоизотопом;
в) специфические АТ-ла или АГ-ны известной концентрации, связанные на сорбенте;
г) стандартный АГ или АТ (контрольный);
д) буферный раствор.
Сначала в реакцию вводят исследуемый АГ (или АТ). Происходит образование комплекса АГ-АТ на поверхности сорбента. Сорбент отмывают, затем вводят меченый АГ (или АТ). Чем больше содержание исследуемого АГ (или АТ), тем меньше меченного АГ (или АТ) связывается с АТ-м (АГ-м) на поверхности сорбента. Концентрацию меченного АГ (или АТ) определяют измерением радиоактивности реакции с помощью счетчиков. Величина радиоактивности реакции будет обратно пропорциональной количеству АГ (АТ) в исследуемой пробе.
2) Неконкурентный метод.
Компоненты реакции:
а) определяемый АГ;
б) специфические АТ-а известной концентрации, связанные на сорбенте;
в) идентичные к связанному антителу антитела, меченые радиоизотопом;
|
|
|
г) стандартный АГ;
д) буферный раствор.
К связанным АТ добавляют исследуемый АГ. В процессе инкубации на сорбенте образуются комплексы АГ-АТ. Сорбент отмывают от свободных компонентов и добавляют меченые АТ, которые связываются со свободными валентностями АГ-на в составе комплекса. Величина радиоактивности пропорциональна концентрации исследуемого АГ.
3) «Сэндвич-метод» (непрямой метод) – наиболее распространённый метод.
Компоненты:
а) исследуемая сыворотка (или исследуемый АГ);
б) АГ-ы, связанные на сорбенте (или АТ-ла, связанные на сорбенте при определении АГ).
в) диагностические АТ против иммуноглобулинов, меченные радиоизотопами;
г) контрольные сыворотки (или АГ-ы)
д) буферные растворы
Исследуемые АТ-а (или АГ-ы) реагируют с твёрдофазными АГ-ми (АТ-ми), после чего инкубат удаляется и в реакцию вводят меченые антиглобулиновые АТ, которые связываются со специфическими комплексами АГ- АТ на поверхности сорбента. Величина радиоактивности реакции прямо пропорциональна количеству исследуемого АТ (или АГ).
Достоинства РИА:
1) высокая специфичность и чувствительность
2) простота техники постановки
3) точность количественной оценки результатов.
4) легко поддаётся автоматизации
Недостаток: использование радиоактивных изотопов.
Дата добавления: 2019-01-14; просмотров: 442; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!