Расчеты для приготовления питательных сред по прописям.

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 19Следующая ⇒

Состав питательных сред имеется в любом микробиологическом справочнике или практическом руководстве в приложении, всегда дается в расчете на 1 литр дистиллированной или водопроводной воды. Однако на практике не всегда требуется готовить 1 литр питательной среды, часто ограничиваются более меньшими объемами: 250, 500 или 750 мл. Поэтому при приготовлении необходимого количества питательной среды необходимо произвести пересчет концентраций элементов среды на нужный объем. Например: необходимо приготовить питательную среду (агар с сахарозой) следующего состава: сахароза – 10 г, K2HPO4 – 1 г, агар – 20 г, вода 1 л. на 500 мл. Поскольку 500 мл это в 2 раза меньший объем, чем 1 литр, то все составляющие данной среды надо уменьшить на половину. И так далее, можно проводить пересчеты на любой объем среды.

Состав среды	г/1 литр	г/500 мл	г/200 мл
сахароза	10	5	2
K2HPO4	1	0,5	0,2
Агар	20	10	4

Контрольные вопросы:

Какие виды питательных сред выделяют по назначению?
Какие виды питательных сред выделяют по консистенции?
Какие требования предъявляют к питательным средам?
Каковы условия стерилизации питательных сред?
Как проверяют питательные среды на стерильность?
Лабораторная работа № 4

Тема: Исследование микроорганизмов в живом состоянии.

Определение подвижности микроорганизмов.

Цель занятия: Овладеть основными навыками и методами исследования микроорганизмов в живом состоянии. Научиться готовить временные препараты микроорганизмов методами «раздавленная» и «висячая» капля. Научиться определять подвижность бактерий.

Материалы и оборудование: Микроскоп, штатив с пробирками культур бактерий, пробирки со стерильной питательной средой, спиртовки, бактериологическая петля, пастеровские пипетки, пинцет, скальпель, вата, дезинфицирующий раствор, промывалка, лоток с мостиком, предметные стекла с лункой, простые предметные стекла, покровные стекла, кусочек хозяйственного мыла, вазелин, спички, салфетки, фильтровальная бумага.

Задания:

Подготовить препараты «раздавленная» капля представителей Protozoa и порядка Hyphomycrobiales изсенного настоя или почвенной суспензии. Рассмотреть их с использованием световой и темнопольной микроскопии и зарисовать в тетрадь.
Подготовить препараты «висячая» капля представителей Protozoa порядка Hyphomycrobiales изсенного настоя или почвенной суспензии. Рассмотреть их с использованием световой и темнопольной микроскопии и зарисовать в тетрадь.
Сделать вывод о возможностях световой и темнопольной микроскопии в изучении микроорганизмов в живом состоянии.
Рассмотреть временные препараты с использованием фазового контраста.
Определить подвижность бактерий.

Методические указания.

Определение подвижности бактерий.Подвижность бактерий - важный видовой признак и производится при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков - специальных тонких нитевидных образований. Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии.

В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют:

а) монотрихи - микроорганизмы имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (род Pseudomonas);

б) лофотрихи - микробы имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков;

в) амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки;

г) перитрихи- микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки (E . coli).

Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.

Для определении подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться.

Определение подвижности бактерий методом «висячая капля». Каплю молодой (18-20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой. Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые.

Метод Шушкевича. Для этого каплю микробной взвеси наносят в конденсат скошенной плотной питательной среды в пробирке. Подвижные микроорганизмы, передвигаясь из конденсата, растут на поверхности среды; неподвижные виды размножаются только в конденсате среды («не заходя» на поверхность агара).

Метод «раздавленная капля». Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят так же как и в методе «висячая капля».

Метод посева уколом в полужидкий агар. Для этого бактериологической петлей производят посев исследуемой культуры уколом до дна пробирки с полужидкой питательной средой. Подвижная культура растет по всей питательной среде, образуя равномерное помутнение, а неподвижная - только по уколу в виде стержня, сохраняя прозрачность незасеянного участка среды.

При исследовании живых клеток можно использовать окрашивание объектов «прижизненными» красителями (витальная окраска). Такими красителями могут служить метиленовый синий, нейтральный красный в концентрациях от 0,001 до 0,0001%.

Оба метода применяют для выявлении подвижности клеток микроорганизмов, наблюдения за размножением, образованием и прорастанием спор, установления реакции микроорганизмов на химические соединения и физические факторы воздействия, изучения размеров клеток, характера их расположения, определения запасных веществ в клетке.

Препараты микроскопируют, слегка затемняя поле зрения; конденсор немного опускают, поступление света регулируют. Вначале пользуются малым увеличением, после того как обнаруживают край капли устанавливают объектив х40. Более четкие результаты можно получить при микроскопировании в темном поле или фазовом контрасте.

Микроскопия в темном поле основана на освещении объекта косыми лучами спектра. Эти лучи, не попадая в объектив, остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит совершенно черным. Если препарат содержит какие-то частицы, например, микроорганизмы, то косые лучи проходят через такой препарат, в значительной степени отражаются от поверхности этих частиц и настолько уклоняются от своего первоначального направления, что попадают в объектив. Тогда наблюдатель видит на черном поле интенсивно светящиеся объекты, даже если их диаметр в 10 раз меньше, чем разрешающая способность объектива. Такое освещение препарата достигается применением специального конденсора А-1,36-1,25; которым заменяют обычный конденсор микроскопа. Темнопольный конденсор имеет затемненную среднюю часть, поэтому центральные лучи света, идущие от зеркала вверх, задерживаются. В плоскость препарата попадают только боковые лучи, отраженные от зеркальных поверхностей, расположенных внутри конденсора. Для темнопольной микроскопии требуется более мощный источник света, чем для микроскопии в светлом поле, так как темнопольный конденсор пропускает лишь незначительную часть поступающего в него светового потока. Приобретает особое значение правильная установка света, максимальное его использование и особенно тщательная центрировка. Работая с темнопольным конденсором, следует обратить внимание также на толщину препарата и чистоту используемых стекол: чем толще препарат и чем больше в нем посторонних частиц, преломляющих свет (пылинки, пузырьки воздуха и т.д.), тем менее контрастным получится изображение, так как каждая частица, отражая лучи, освещает поле зрения. При соблюдении всех необходимых условий получают ослепительно яркими объекты на интенсивно черном фоне. Величина этих объектов этих объектов может измеряться сотыми долями микрона, т.е. разрешающая способность, в случае использования темнопольного конденсора, в 10 раз больше, чем при светлопольной микроскопии. Таким образом, микроскопия в темном поле позволяет увидеть объекты, лежащие за пределами видимости обычного микроскопа. Необходимо отметить, что при наблюдении объектов в темном поле различают только их контуры (особенно это относится к очень мелким объектам), что не дает возможности судить об их внутреннем строении.

Фазово-контрастная микроскопия. Контрастность изображения находится в прямой зависимости от степени поглощения света различными структурными элементами объекта. Если в объективе чередуются места сильно и слабо адсорбирующие свет, то последний проходя через объект, изменяет свою структуру. Интенсивность световых лучей, прошедших через различные участки такого объекта, будет различной. Такие препараты называются амплитудными.

Наряду с амплитудными, существуют совершенно прозрачные объекты. Пройдя через такие объекты, свет или совсем не ослабляется, или ослабляется чрезвычайно мало. Однако в зависимости от различных показателей преломления отдельными участками объекта или его неравномерной толщины, по выходе из объекта смещается фаза светового колебания. Сдвиг фазы происходит из-за неодинаковой скорости распространения света в средах с различной оптической плотностью. В местах большей оптической плотности свет как бы замедляет свою скорость, изменяется по форме. Такие объекты называются фазовыми. К ним относятся большинство живых клеток микроорганизмов. Глаз человека фазовые колебания света не выявляет. Для их обнаружения служит метод фазовых контрастов, предложенный в 1934 году Цернике. Метод фазовых контрастов основан на использовании теории Аббе о дифракционном построении изображения в микроскопе.

Контрольные вопросы:

Методы изучения подвижности бактерий.
Виды микроорганизмов по расположению жгутиков, приведите примеры.
Как приготовить препараты «раздавленная» капля, «висячая» капля?
В чем состоит метод Шушкевича для определения подвижности бактерий?
Особенности темнопольной микроскопии.
Микроскопирование в фазовом-контрасте.

Лабораторная работа № 5

Дата добавления: 2018-10-26; просмотров: 2684; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!