Методы приготовления и стерилизации питательных сред.
Цель занятия: Ознакомиться с различными видами питательных сред, используемых в микробиологии. Научиться готовить питательные среды по прописям. Познакомиться с методами стерилизации питательных сред.
Материалы и оборудование: химические реактивы, колбы, стеклянные воронки, плитка, фильтровальная бумага, марля, весы, прописи питательных сред, автоклав.
Задания:
- Приготовить питательные среды МПА, агар Чапека, крахмало-аммиачный агар, картофельный агар, голодную среду, среды для выделения различных групп микроорганизмов.
- Сварить и профильтровать среды, подготовить их к стерилизации в автоклаве.
- Познакомиться с методами стерилизации питательных сред.
- Простерилизовать среды в автоклаве под руководством преподавателя.
Методические указания:
Питательные среды. Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифицировано Левином и Шёнлейном еще в 1930 г), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк - от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганизмов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа питательных сред: так называемые синтетические среды, главные составные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизвестен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).
|
|
|
Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за повсеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства ее временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава типа бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма широко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.
|
|
|
В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы органогены: азот, углерод, водород, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды. По характеру усвоения азота микроорганизмы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты неполного ферментативного переваривания белков. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии нативного, т. е. неизмененного, белка. Источником углерода для бактерий являются главным образом различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли. Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, KH2P04, K2HP04 и т. д.
|
|
|
Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой. Наряду с перечисленными органическими и неорганическими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины. Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды. Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.
По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовят из; жидких питательных сред посредством прибавления к ним клеевых веществ агара или желатина. Агар-агар (по-малайски желе) - продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80-86° С, застудневает при 36-40° С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37°С дало возможность выращивать микробов при оптимальной для большинства из них температуре на плотных средах. Желатин - вещество белковой природы животного происхождения. В теплой воде при температуре 32-34°С он набухает и растворяется, а при более низкой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает.
|
|
|
Требования, предъявляемые к питательным средам.
Питательные среды должны:
1. Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.
2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.
3. Иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса.
4. Обладать изотоничностью.
5. Быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов.
Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.
К первой группе относятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба.
К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические.
Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной.
Дифференциально-диагностические среды. Эти питательные среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом:
1. Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т. п.
2. Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами.
3. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.
4. Среды для определения редуцирующей способности микробов.
В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.
Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред - один из наиболее ответственных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов. Готовят среды по прописи, указанной на этикетке. Постоянство состава, стандартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуществом сухих питательных сред. После установления соответствующего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.
Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.
1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С.
2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112° С.
3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.
4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.
Подготовленные питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37°С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сут, простерилизованные текучим паром - 3 сут.
Дата добавления: 2018-10-26; просмотров: 1829; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!