Устройство светового микроскопа и работа с ним.

Микроскоп - сложный оптический прибор, используемый для изучения морфологии и тинкториальных свойств микроорганизмов. Принципиально все микроскопы устроены одинаково и состоят из механической части и оптической системы.

Механическую часть составляют: основание микроскопа, тубусодержатель, тубус, система винтов для передвижения, предметный столик и револьвер. Оптическую часть составляют - окуляр, объективы и осветительный аппарат.

Работа с иммерсионной системой. Объективы малого увеличения (8, 10) применяют главным образом для предварительного осмотра препарата, объективы среднего увеличения (20, 40) - для изучения крупных клеток микроорганизмов (например, грибов); эти объективы называются сухими, поскольку при микроскопии между фронтальной линзой и препаратом находиться воздух. При этом благодаря различию показателей преломления воздуха (n=1) и стекла (n=1,52) часть лучей, освещающих препарат, рассеивается и не попадает в объектив.

Объективы больших увеличений (85, 90; 100) носят название иммерсионных. При работе с ними необходима максимальная освещенность препарата; устранение рассеивания, неизбежного при работе с сухими объективами, в данном случае достигается путем использования иммерсионных жидкостей, у которых показатель преломления близок к показателю преломления стекла.

Вначале под малым увеличением микроскопа наводят свет и определяют на препарате участок микроскопирования. Затем на выбранное место наносят каплю иммерсии и осторожно (под контролем глаз с боку) погружают в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива (100). Иммерсионные объективы имеют короткое фокусное расстояние (до 2,3 мм) поэтому наводить на резкость следует путем поднимания объектива, а не опускания его, так как при небольшом рабочем расстоянии можно раздавить препарат и повредить фронтальную линзу. После грубой наводки, которую проводят с помощью макрометрического винта, руки переводят на микрометрический винт и осуществляют точную фокусировку. По окончании работы объектив поднимают, убирают препарат, а с фронтальной линзы кусочком хлопчатобумажной ткани, смоченной бензином или этиловым спиртом, убирают иммерсию. После работы с иммерсионным объективом необходимо установить микроскоп на малое освещение, обесточить микроскоп и накрыть защитной пленкой для предотвращения попадания пыли на оптическую систему.

 

Контрольные вопросы:

1. В чем заключаются правила работы в бактериологической лаборатории?
2. Для какой цели служит бокс?
3. Как установить освещение микроскопа по методу Келера?
4. Как установить препарат для наблюдений?
5. Заполнить форму 1, указав назначение каждого помещения в бактериологической лаборатории.

Форма 1

Типы помещений	Назначение
Лабораторная
Бокс с предбоксником
Моечная
Средоварня
Материальная комната
Автоклавная
Холодная комната (холодильник)
Теплая комната (термостат)

 

 

Лабораторная работа № 2

Тема: Лабораторная посуда и её подготовка.

Методы стерилизации лабораторной посуды.

Цель занятия. Подготовить посуду. Ознакомиться с методами стерилизации лабораторной посуды. Получить навыки работы по приготовлению ватно-марлевых пробок. Научиться готовить посуду для стерилизации в автоклаве. Познакомиться со строением и работой автоклава.

Оборудование и материалы. Штативы, пробирки, микробиологические петли, пипетки, шпатели Дригальского, пипетки. чашки Петри, бумага крафта. Автоклав, сушильный шкаф, фильтры Зейтца, вата, марля.

Задания:

1. Сделать ватно-марлевые пробки для колб и пробирок.
2. Завернуть чашки Петри, шпатели Дригальского, пипетки для стерилизации в автоклаве.
3. Познакомиться с устройством и работой автоклава, сушильного шкафа и фильтров для холодной стерилизации.
4. Простерилизовать посуду в автоклаве под руководством преподавателя.
5. Профильтровать жидкость через фильтр Зейтца.

Методические указания.

Мытье и обработка лабораторной посуды. Для мытья лабораторной посуды в микробиологических лабораториях отводится отдельное помещение — моечная.

Сильно загрязненную посуду со следами жира обрабатывают в хромовой смеси. Хромовая смесь, будучи сильным окислителем, разрушает органические вещества с образованием растворимых или газообразных продуктов. Перед употреблением хромовую смесь подогревают до температуры 45 - 50°С, а затем заливают ею грязную посуду.

Мытье новой лабораторной посуды. В ведре с теплой водой растворяют хозяйственное мыло, чтобы образовалось небольшое количество пены, погружают в нее посуду и ставят на слабый огонь. После 15-минутного кипячения посуду вынимают, ополаскивают чистой водой, погружают в теплый 1—2% раствор хлористоводородной кислоты, доводят до кипения и вываривают 10—15 мин, чтобы нейтрализовать избыток щелочи, который мог остаться при изготовлении стекла. После кипячения в кислоте посуду прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной.

При мытье посуды, служащей для постановки серологических реакций, кислоты и щелочи использовать не рекомендуется, так как даже следы этих веществ, оставшиеся на стенках, могут исказить результат реакции. Такую посуду моют горячей водой, кладут на сетки, чтобы с нее стекла вода, затем несколько раз ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу.

Мытье лабораторной посуды, бывшей в употреблении. Посуда, в которой содержался зараженный материал, автоклавируют в режиме, гарантирующем гибель находящихся в ней патогенных микробов. Перед мытьем из пробирок, чашек и матрацев обеззараженную жидкость выливают. Не очень загрязненную посуду моют ершом в горячей воде с мылом, содой или в растворе горчицы. Очень загрязненную жирную посуду, не поддающуюся мытью обычным способом, заливают на 30—40 мин хромовой смесью, а затем в течение продолжительного времени промывают проточной водопроводной водой.

Простой и надежный способ мытья и обеззараживания лабораторной посуды предложен Г. П. Кирсановым (1972). Отработанную лабораторную посуду стерилизуют в автоклаве в течение 2 ч при 2 атм. После стерилизации, посуду загружают в бак и заливают раствором, содержащим на 100 мл дистиллированной воды 5 мл нашатырного спирта и 3 г порошка для стирки хлопчатобумажного и льняного белья. Лабораторная посуда хорошо отмывается и обезжиривается в течение 30 мин кипячения в указанном растворе, затем ее прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной. После этого, посуду высушивают в сушильном шкафу. А.В. Ивановым и соавт. (1974) предложен простой и экономичный способ. Использованные пробирки со средами автоклавируют при 1,5 атм. в течение 30 мин, затем по 250 - 300 пробирок укладывают в бачки или эмалированные ведра с плотной крышкой, заливают 1% раствором едкого натра и кипятят в течение 2 ч. Во время кипячения остатки питательной среды растворяются, и образуется однородная жидкая мыльно-щелочная смесь, способствующая освобождению пробирок от плотных остатков среды. После 2 ч кипячения мыльно-щелочной раствор переливают в другое ведро для повторного использования (раствор может быть использован 3-4 раза). Прокипяченные отмытые пробирки несколько раз прополаскивают водопроводной водой и высушивают.

Посуду, используемую для приготовления и хранения питательных сред и культивирования микробов, нельзя обрабатывать дезинфицирующими веществами, так как даже следы их делают питательную среду непригодной для размножения микроорганизмов.

Мытье градуированных пипеток. Пипетки и другая градуированная посуда, поступающие для работы, должны быть абсолютно чистыми и хорошо обезжиренными. На стенках плохо обезжиренной посуды при вливании жидкости остается большое количество капель, вследствие чего слитый объем жидкости не будет соответствовать той величине, которая указана на шкале деления.

Градуированные пипетки, моют следующим образом. С помощью резинового баллончика, надетого на пипетку, насасывают в нее горячую мыльную воду и погружают затем в сосуд с такой же водой. Чтобы вода из пипеток не вытекала, уровень жидкости в сосуде должен соответствовать высоте пипеток. Выдержав 20-30 мин в мыльном растворе, пипетки прополаскивают водопроводной водой и переносят в 1-2% раствор хлористоводородной кислоты, который постепенно доводят до кипения. Далее пипетки обрабатывают так же, как и остальную стеклянную посуду. Закупорившийся канал пипетки прочищают мандреном от тонких игл шприцов. Промытые пипетки складывают в таз, заливают теплым раствором горчицы или мыльной водой и ставят на слабый огонь. После 20-30-минутного кипячения пипетки вынимают и ополаскивают сначала теплой проточной водой, а затем дистиллированной. Сильно загрязненные пипетки также очищают ершом с мылом или содой, и погружают в хромовую смесь, налитую в ванночку или банку, по высоте соответствующую длине обрабатываемых пипеток. В хромовой смеси пипетки выдерживают 20-30 мин, затем в течение нескольких минут промывают проточной и дважды ополаскивают дистиллированной водой.

Сушка и хранение чистой лабораторной посуды. Высушенную посуду просматривают на свет. Стекло ее должно быть совершенно прозрачным, без матового налета и пятен. Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре или горячим воздухом в сушильном шкафу при температуре 100-105°C.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ

Стерилизация предусматривает в стерилизуемом объекте уничтожение всех вегетативных и споровых микроорганизмов и проводят её различными способами: паром, сухим горячим воздухом, кипячением, фильтрацией и т. д. Выбор того или иного способа стерилизации определяется качеством и свойствами микрофлоры стерилизуемого объекта.

Подготовка и стерилизация лабораторной посуды. Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутыли, матрацы и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажные колпачки. Резиновые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в отдельном пакете, привязанном к горлышку посуды. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1-6 штук. Пастеровские пипетки по 3-15 шт. заворачивают оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в рот. При завертывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать запаянные концы капилляров. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.

В верхнюю часть градуированных пипеток, как и в пастеровские пипетки, вставляют предохранительную вату и затем заворачивают в плотную бумагу, нарезанную предварительно диагональными полосками шириной 2-2,5 см и длиной 50-70 см. Полоску кладут на стол, левый конец ее загибают и завертывают им кончик пипетки, затем, вращая пипетку, навертывают на нее ленту бумаги. Для того чтобы бумага не разворачивалась, противоположный конец ее закручивают или приклеивают. На бумаге надписывают объем завернутой пипетки. При наличии пеналов градуированные пипетки стерилизуют в них.

Лабораторную посуду стерилизуют: а) сухим жаром при температуре 175°С 1 ч., б) в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 20-30 мин.

Стерилизация металлических инструментов. Металлические инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты и пр.) стерилизуют в 2% растворе гидрокарбоната натрия, который предупреждает появление ржавчины и потерю остроты. Лезвия скальпелей и ножниц перед погружением в раствор рекомендуется обертывать ватой.

Стерилизация бактериальных петель. Бактериальные петли, сделанные из платиновой или нихромовой проволоки, стерилизуют в пламени спиртовой или газовой горелки. Такой способ стерилизации получил название прокаливания или фламбирования. Петлю в горизонтальном положении вносят в нижнюю, наиболее холодную, часть пламени горелки, чтобы не произошло разбрызгивания сжигаемого патогенного материала. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, затем верхнюю часть проволоки и прожигают петле держатель. Прокаливание в целом занимает 5—7 секунд.

Подготовка к стерилизации и стерилизация бумаги, марли и ваты. Вату, марлю, фильтровальную бумагу стерилизуют в сухожаровой печи при температуре 160°С в течение часа от момента показания термометром данной температуры или в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30 мин.

Перед стерилизацией бумагу и марлю нарезают кусочками, а вату сворачивают в виде шариков или тампонов нужной величины. После этого каждый вид материала в отдельности по одной или несколько штук заворачивают в плотную бумагу. При разрыве пакета простерилизованный материал следует стерилизовать повторно, так как стерильность его нарушается.

Стерилизация перчаток и других резиновых изделий. Изделия из резины (перчатки, трубки и т. д.), загрязненные вегетативной формой микробов, стерилизуют кипячением в 2% растворе гидрокарбоната натрия или текучим паром в течение 30 мин; при загрязнении спороносной микрофлорой - в автоклаве при давлении 1,5-2 атм. в течение 30 или 20 мин. Резиновые перчатки перед стерилизацией внутри и снаружи пересыпают тальком для предохранения их от склеивания. Между перчатками прокладывают марлю. Каждую пару перчаток завертывают отдельно в марлю и в таком виде помещают в биксы.

Стерилизация культур микробов. Пробирки и чашки, содержащие культуры микробов, не нужные для дальнейшей работы, складывают в металлический бак, пломбируют крышку и сдают на стерилизацию. Культуры микробов, вегетативные формы, убивают в автоклаве в течение 30 мин при давлении 1,5 атм. Сдача баков для стерилизации в автоклавную производится специально выделенным лицом под расписку. Режим стерилизации регистрируется в специальном журнале.

ВИДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ.

Стерилизация кипячением производят в стерилизаторе. В стерилизатор наливают дистиллированную воду, так как водопроводная образует накипь. (Стеклянные предметы погружают в холодную, металлические предметы - в горячую воду с добавлением гидрокарбоната натрия). Стерилизуемые предметы кипятят на слабом огне. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения инструменты берут стерильным пинцетом, который кипятят вместе с остальными предметами.

Стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера. Подготовленный к стерилизации материал кладут на полки так, чтобы он не соприкасался со стенками. Шкаф закрывают и после этого включают обогрев. Продолжительность стерилизации при температуре 150°С 2 ч, при 165°С - 1 ч, при 180°С - 40 мин, при 200°С - 10-15 мин (при 170°С бумага и вата желтеют, а при более высокой температуре обугливаются). Началом стерилизации считается тот момент, когда температура в печи достигнет нужной высоты. По окончании срока стерилизации печь выключают, но дверцы шкафа не открывают до полного охлаждения, так как холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде.

Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Автоклав состоит из двух котлов, вставленных один в другой, кожуха и крышки. Наружный котел называют водопаровой камерой, внутренний — стерилизационной камерой. В водопаровом котле происходит образование пара. Во внутренний котел помещают стерилизуемый материал. В верхней части стерилизационного котла имеются небольшие отверстия, через которые проходит пар из водопаровой камеры. Крышка автоклава герметически привинчивается к кожуху. Кроме перечисленных основных частей, автоклав имеет ряд деталей, регулирующих его работу: манометр, водомерное стекло, предохранительный клапан, выпускной, воздушный и конденсационный краны. Манометр служит для определения давления, создающегося в стерилизованной камере. Нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимается за нуль, поэтому в неработающем автоклаве стрелка манометра стоит на нуле. Между показаниями манометра и температурой имеется определенная зависимость. Красная черта на шкале манометра определяет максимальное рабочее давление, которое допускается в автоклаве.

Предохранительный клапан служит для предохранения от чрезмерного повышения давления. Его устанавливают на заданное давление, т. е. давление, при котором нужно производить стерилизацию, при переходе стрелки манометра за черту клапан автоклава автоматически открывается и выпускает лишний пар, замедляя тем самым дальнейший подъем давления. На боковой стенке автоклава имеется водомерное стекло показывающее уровень воды в водопаровом котле. На трубке водомерного стекла нанесены две горизонтальные черты — нижняя и верхняя, обозначающие соответственно допускаемый нижний и верхний уровень воды в водопаровой камере. Воздушный кран предназначен для удаления воздуха из стерилизационной и водопаровой камер в начале стерилизации, так как воздух, являясь плохим проводником тепла, нарушает режим стерилизации. На дне автоклава находится конденсационный кран для освобождения стерилизационной камеры от конденсата, образующегося в период нагревания стерилизуемого материала. Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. После этого интенсивность подогрева уменьшают, чтобы давление в автоклаве в течение нужного времени оставалось на одном уровне. По окончании времени стерилизации подогревание прекращают. Закрывают вентиль в трубопроводе, подающем пар в стерилизационную камеру, и открывают вентиль на конденсационной (нисходящей) трубе для снижения давления пара в камере. После падения стрелки манометра до нуля медленно ослабляют прижимные приспособления и открывают крышку автоклава. Температура и продолжительность стерилизации определяются качеством стерилизуемого материала и свойствами тех микроорганизмов, которыми он заражен.

Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в автоклаве при не завинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняют на 2/3 водой (для спуска оставшейся после стерилизации воды есть кран). Крышка аппарата имеет в центре отверстие для термометра и несколько небольших отверстий для выхода пара. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата неплотно, чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром. Началом стерилизации считается время с момента закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру. В текучепаровом аппарате стерилизуют главным образом питательные среды, свойства, которых изменяются при температуре выше 100°С. Стерилизацию текучим паром следует проводить повторно, так как однократное прогревание при температуре 100°С не обеспечивает полного обеспложивания. Такой метод получил название дробной стерилизации: обработку стерилизуемого материала текучим паром проводят по 30 мин ежедневно в течение 3 дней. В промежутках между стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.

Тиндализация - дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемого материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу при температуре 60-65°С в течение 5 дней или при 70-80 C в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями обрабатываемый материал выдерживают при температуре 25°С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях. Тиндализацией пользуются для обеспложивания питательных сред, содержащих белок.

Механическую стерилизацию с помощью бактериальных фильтров применяют для освобождения жидкости от находящихся в ней бактерий, а также для отделения бактерий от вирусов, фагов и экзотоксинов. Вирусы бактериальными фильтрами не задерживаются, и поэтому ультрафильтрацию нельзя рассматривать как стерилизацию в принятом значении этого слова. Для изготовления фильтров применяют мелко пористые материалы (каолин, асбест, нитроцеллюлоза и др.), способные задерживать бактерий. Асбестовые фильтры (фильтры Зейтца) представляют собой асбестовые пластинки толщиной 3-5 мм и диаметром 35 и 140 мм для фильтрации малых и больших объемов жидкости. В нашей стране асбестовые фильтры, изготовляют двух марок: “Ф” (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие бактерий, и “СФ” (стерилизующие), более плотные, задерживающие бактерий. Перед употреблением асбестовые фильтры монтируют в фильтровальные аппараты и вместе с ними стерилизуют в автоклаве. Асбестовые фильтры используются однократно. Мембранные ультрафильтры изготавливают из нитроклетчатки и представляют собой диски белого цвета. Непосредственно перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением. Фильтры помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50-60°С, чтобы предупредить их скручивание, кипятят на слабом огне в течение 30 мин, меняя 2-3 раза воду. Простерилизованные фильтры во избежание их повреждения вынимают из стерилизатора фламбированным и остуженным пинцетом с гладкими кончиками.

Для фильтрации жидкостей монтируют в специальные фильтровальные приборы: в частности Зейтца. Он состоит из 2-х частей: верхней, имеющей форму цилиндра или воронки, и нижней - опорной части аппарата, с так называемым фильтровальным столиком из металлической сетки или чистой керамической пластинки, на которую помещают мембранный или асбестовый фильтр. Опорная часть аппарата имеет форму воронки, суживающаяся часть которой в резиновой пробке горлышка колбы Бунзена. В рабочем состоянии верхнюю часть прибора фиксируют на нижней с помощью винтов. Перед началом фильтрации, места соединения различных частей установки, для создания герметичности, заливают парафином. Отводную трубку колбы присоединяют толстостенной резиновой трубкой к водоструйному, масляному или велосипедному насосу. После этого в цилиндр или воронку аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают в действие насос, создающий вакуум в приёмном сосуде. В результате образующей разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приёмник. Микроорганизмы остаются на поверхности фильтра.

Контрольные вопросы:

1. Что такое стерилизация и какими способами ее осуществляют?
2. Как подготовить стеклянную посуду к стерилизации?
3. Опишите устройство и режим работы автоклава.
4. Что такое стерилизация текучим паром?
5. С какой целью проводят дробную стерилизацию?
6. Что такое химическая стерилизация и где ее используют?
7. Что такое биологическая стерилизация и как ее осуществляют?

 

 

Лабораторная работа № 3

Тема: Питательные среды.

---

Дата добавления: 2018-10-26; просмотров: 446; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!