Метод радиальної імунодифузії у гелі
Метод був запроновані Манчіні (Manchini та інші, 1964) і є найбільш розповсюдженим у клініці завдяки простоті та надійності.
Суть методу. На планшет рівномірно наносять гель агару (агарози), до якого додані антитіла до імуноглобулінів відповідного класу (анти-Ig). Після затвердіння у гелі вирізають лунки, які заповнюють досліджуваною біологічною рідиною (наприклад, сироваткою крові). Молекули антигену (у нашому випадку, Ig відповідного класу) радіальне дифундують із лунки і, зустрівшись із антитілами, утворюють коло преципітації. Площа утвореного преципітату прямо пропорційна логарифму концентрації імуноглобулінів у досліджуваній рідині
При постановці реакції використовують декілька стандартів з відомою концентрацією антигену. Шляхом побудови калібрувальної кривої або математичного обчислення визначають кількість антигена у зразках.
Визначення кількості імуноглобулінів важливе при діагностичному та клінічному моніторингу первинних імунодефіцитів, моноклональних гаммапатій, аутоіммуних захворюваннях та інших патологіях.
Середній вміст імуноглобулінів для різних вікових груп:
| Вікові групи | Кількість іммуноглобулінів | |||||
| Ig G | Ig A | Ig M | ||||
| Середнє значення | коливання | Середнє значення | коливання | Середнє значення | коливання | |
| До 1 року | 60 | 33-109 | 36 | 14-80 | 84 | 47-154 |
| 1-3 р. | 95 | 62-143 | 68 | 33-143 | 99 | 55-180 |
| 3-7р. | 109 | 70-168 | 108 | 58-201 | 106 | 64-176 |
| 7-16р. | 111 | 72-172 | 160 | 80-319 | 103 | 63-172 |
| 20-35 р | 129 | 86-195 | 214 | 128-359 | 120 | 69-206 |
| 19-60 р. | 150 | 95-235 | 110 | 55-250 | 160 | 6-405 |
|
|
|
Клінічне значення оцінки популяціонного складу лімфоцитів:
Кількісна оцінка хелперів/індукторів та цитотоксичних Т-лімфоцитів, а також визначення їх співвідношення (іммунорегуляторний індекс) важливі при дослідженні імунної системи та моніторингу пацієнтів з імунодефіцитним станом, аутоімунними захворюваннями або імуними реакціями, такими, як реакція відторгнення трансплантанту або трансплантант проти хазяїна.
Лікар повинен звертати увагу на відповідність характеру відхилення показників, що мають значення при тій чи іншій патології.
Методи, які базуються на дослідженні поверхневих маркерів лімфоцитів
На сьогодні для ідентифікації поверхневих структур лімфоцитів та низки інших клітин використовують три групи методів:
1) методи імунофлюоресценції;
2) імуноферментні методи;
3) розеткоутворення.
Методи імунофлюоресценції
Найпрогресивнішим і найточнішим методом ідентифікації поверхневих структур лімфоцитів сьогодні є метод лазерної проточної цитофлюориметрії.
Флюоресцентні методи базуються на такому феномені: молекули антитіл поєднати з молекулами флюоресцентних барвників, то їхня специфічна активність у плані приєднання до відповідних антигенів повністю зберігається.
|
|
|
Прямий метод імунофлюоресценції полягає у використанні анти-СD-моноклональних антитіл, до яких приєднана флюоресцентна мітка (найчастіше-ФІТЦ), який дає в ультрафіолетових променях зеленувате свічення). У таблиці наведені диференціювальні антигени лімфоцитів, які можна виявити за допомогою відповідних моноклональних антитіл. Сьогодні розроблені гібридомні технології отримання моноклональних антитіл до відповідних антигенів мембран клітин. Визначення можна проводити як у суспензії лімфоцитів, так і у цільній крові. Обов'язковим етапом є інкубація клітин з моноклональними антитілами, кон’югованими з фітохроами, зокрема ФІТЦ. Результати обраховують за допомогою проточного цитофлюориметра, який ідентифікує клітини за розмірами (популяції лімфоцитів, моноцитів, гранулоцитів), за інтенсивністю свічення (чисельність субпопуляцій, щільність рецепторів на мембранах клітин).
При відсутності у лабораторії прилада - проточного цитофлюориметра - можна для підрахунку клітин використовувати флюоресцентний мікроскоп. При спостереженні у мікроскоп клітин, оброблених міченими антитілами, можна виявити характерні зони свічення у вигляді кол (німбів), які вказують на те, що на поверхні даної клітини експресовані відповідні диференційні антигени.
|
|
|
Імуноферментні методи
Метод передбачає використання немічених моноклональних антитіл, які інкубують з клітинами. Візуалізація реакції здійснюється за допомогою допоміжних антитіл (наприклад, антитіла кози проти імуноголобулінів миші, якщо моноклональні антитіла були отримані на основі мишиної гібридоми). До допоміжних антитіл приєднується пероксидазна мітка, внаслідок чого при взаємодії фермент-субстрат виникає реакція, яку можна спостерігати за допомогою мікроскопу. Цей метод використовують невеликі лабораторії, які не мають дорогого обладнання.
Методи розеткоутворення
Використовуються у клінічній імунології з початку 70-х років. Методи розеткоутворення є найдешевшими серед методів кількісного визначення субпопуляцій лімфоцитів. Методи розеткоутворення засновані на феномені прилипання до поверхні клітини корпускулярних часток. Найбільш простими є методи розеткоутворення з еритроцитами тварин. Тест розеткоутворення з еритроцитами барана (Е-РУЛ) використовують для виявлення Т- лімфоцитів (доведено, що СD2 рецептори Т-лімфоцитів ідентичні Е - рецепторам і мають спорідненість до глікопротеїнів мембрани еритроцитів барана). Тест розеткоутворення з еритроцитами миші (М-РУЛ) використовують для виявлення В- лімфоцитів.
|
|
|
Для постановки реакції суспензію лімфоцитів інкубують з суспензією еритроцитів тварин. Після цього підраховують кількість клітин, які утворили розетки. Розеткою називають клітину, до якої прикріплені не менше, ніж три еритроцити.
При підрахунку знаходять 100 або 200 лімфоцитів і вираховують відсоток розеток серед них. Знаючи загальну кількість лімфоцитів, можна кількісно підрахувати чисельність популяцій.
Відносна кількість основних субпопуляцій лімфоцитів в крові:
| Показник | 0-3 мес. | 3-12 мес. | 1-2 роки | 2-6 років | 6-16 років | 16-80 років |
| CD3+ (Т-лф) | 55-78% | 45-79% | 53-81% | 62-80% | 66-76% | 55-80% |
| CD4+ (Т-хелпер) | 41-64% | 36-61% | 31-54% | 35-51% | 33-41% | 31-51% |
| CD8+ (Т- кілер) | - | - | - | - | - | 19-37% |
| CD3+/ CD4+ | 41-64% | 36-61% | 31-54% | 35-51% | 33-41% | 31-49% |
| CD3+/ CD8+ | 16-35% | 16-34% | 16-38% | 22-38% | 27-35% | 12-30% |
| CD3-/CD16+/ CD56+ (ПК) | 2-14% (1-4 м) | 2-13% (4-12м) | 3-16% | 4-23% | 4-27% | 6-20% |
| CD3+/HLA-/DR+ (акт.Т-лф) | 1-9% (1-4 м) | 1-7% (4-12м) | 3-12% | 3-13% | 1-8% (6-9р) 3-14% (9-12р) 1-8% (12-16р) | 0-12% |
| CD19+ (В-лф) | 19-31% | 19-31% | 19-31% | 21-28% | 12-22% | 5-19% |
| CD20+ (зрілі В-лф) | 19-31% | 19-31% | 19-31% | 21-28% | 12-22% | 5-19% |
| CD4+/ CD8+(ІРІ) | - | - | - | - | - | 1,0-2,5% |
| CD3+/CD4+, CD3+/ CD8+ | - | - | - | - | - | 1,5-3,0% |
Клінічне значення визначення субпопуляції лімфоцитів:
Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 229; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!