Методы стерилизации, аппаратура и режимы стерилизации, используемые в бактериологической лаборатории.
Стерилизация сухим жаром применяется для обеспложивания стеклянной посуды, пробирок, колб, чашек Петри и пипеток. Для этой цели используют сухожаровые шкафы (печи Пастера), в который необходимый эффект достигается при температуре 160 градусов в течение 2 часов или при температуре 170 градусов в течение 40 минут.
Принципиальные преимущества сухого жара заключаются в том, что при его применении не происходит коррозии металлов и инструментов, не повреждаются стеклянные поверхности. Он пригоден для стерилизации порошков и не содержащих воды нелетучих вязких жидкостей.
Стерилизация паром под давлением – один из наиболее эффективных методов, основанный на сильном гидролизирущем действии насыщенного пара. Паром под давлением стерилизуют различные питательные среды (кроме содержащих нативные белки): жидкости, приборы, резиновые предметы, стеклянную посуду с резиновыми пробками. Для этого применяют автоклавы.
Питательные среды, перевязочные материалы и белье стерилизуют при 1атм 15-20 минут, питательные среды с углеводами – при 0,5атм 15 минут, а патогенный материал обеззараживают при 2атм.
12. Использование реакций Аг+Ат (РА, РИГА, РП) для идентификации бактерий
РА. Проводят на предметных стеклах. Для этого на обезжиренное стекло наносят пастеровской пипеткой несколько капель сыворотки в небольших (1:10 – 1:20) разведениях и каплю ИХН для контроля. Для идентификации в каждую каплю сыворотки, а также в каплю контроля вносят петлю суточной культуры испытуемого микроорганизма, взятой с поверхности плотной питательной среды. Для выявления АТ в исследуемой сыворотке крови в нее, как и в каплю ИХН, пастеровской пипеткой вводят по 1 капле взвеси известных микроорганизмов (диагностикума). Внесенную культуру тщательно перемешивают до получения суспензии.
|
|
|
Реакция происходит при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают невооруженным глазом через 2-5 минут, иногда для этого используют лупу. Если предметные стекла поместить во влажную камеру, что бы исключить испарение капель, то результаты реакции можно учитывать и позже.
При положительной реакции в капле сыворотки отмечают появление хлопьев (крупных и мелких), хорошо видимых на темном фоне при покачивании предметного стекла. При отрицательной реакции жидкость остается равномерно мутной, как и в контроле.
РНГА. Применяется для идентификации бактериальных и вирусных аг а исследуемом материале, а так же для экспресс-диагностики ряда инфекций.
В данной реакции эритроциты сенсибилизируют антителами. Частицы антительного эритроцитарного диагностикума склеиваются при добавлении аг.
|
|
|
Готовят двукратные разведения исследуемого материала в стабилизирующем растворе. Вносят по одной капле каждого разведения аг в три соседние лунки планшета (реакция занимает три параллельных ряда лунок). В каждую лунку первого ряда вносят по 1 капле стабилизирующего раствора, второго ряда – по одной капле гомологичной иммунной сыворотке, третьего ряда – по 1 капле гетерологичной иммунной сыворотке. Второй и третий ряды служат контролем специфичности реакции. Смесь оставляют на 20 минут при комнатной температуре. Затем во все лунки добавляют по 1 капле 1% суспензии эритроцитарного антительного диагностикума и тщательно встряхивают планшеты. Результаты реакции учитывают через 30-40 минут. При наличии специфического аг гемагглютинация наблюдается в первом и третьем рядах и отсутствует во втором ряду, где аг предварительно нейтрализован гомологичной сывороткой. Реакцию сопровождают контролями сенсибилизированных эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации.
РП (реакция кольцепреципитации). В узкую пробирку (диаметр 0,5см) наливают 0,3-0,5мл неразведенной преципитирующей сыворотки. Пастеровской пипеткой медленно наслаивают по стенке (пробирку держат наклонно) аг в таком же объеме. Затем пробирку осторожно, что бы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении аг на сыворотку четко видна граница между двумя жидкостями. РП должна обязательно сопровождаться контролем аг и сыворотки. Результаты учитывают в зависимости от вида микроорганизма через 5-10 минут, 1-2 часа, 20-24 часа. В случае положительной реакции в случае в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым материалом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.
|
|
|
РП (реакия преципитации в геле). Основана на взаимодействии гомологичных аг и ат в агаровом геле с образованием видимых полос преципитации. Аг и ат в результате встречной диффузии в гель образуют макромолекулярные иммунные комплексы, регистрируемые визуально.
В застывшем агаре вырезают лунки, удаляя из них гель пастеровской пипеткой. В одни лунки вносят ат, в другие – аг. И оставляют во влажной камере на несколько дней. Учитывая результаты реакции, сравнивают локализацию и характер линий преципитации возле опытных лунок и контрольной тест-системы.
14. Использование реакций Аг+Ат с мечеными компонентами (РИФ, ИФА, РИА) для идентификации бактерий
РИФ. Основана на использовании флюоресцеинизотиоционата или других флюорохромов, химически связанных с ат. При этом меченные ат сохраняют свою иммунологическую специфичность. И вступают во взаимодействие со строго определенными корпускулярными аг. Комплексы аг и меченными ат можно легко определить по интенсивному желто-зеленому свечению при изучении препарата в люминисцентном микроскопе.
|
|
|
Прямая РИФ ставится следующим образом: препарат окрашивается специфической меченой антисывороткой во влажной камере 30 минут при 25 градусах.
Непраямая РИФ проводится в 2 этапа с использованием двух различных антисывороток. В начале применяют немеченые ат против искомого аг, а на втором этапе образовавшийся комплекс ат-аг обрабатывают люминесцирующей антисывороткой, содержащей меченые ат против гамма-глобулина того вида животного, на котором была получена немеченая антисыворотка, использованная на первом этапе реакции.
ИФА. Метод основан на использовании для метки ат ферментов, способных разгалать субстрат и приводить к образованию окрашенных продуктов. Коъюшированные с ферментом ат сохраняют способность соединяться с гомологичными аг. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов аг-ат+фермент. В качетве ыерментов чаще всего используют пероксидазу, щелочную фосфотазу. Субстратом для пероксидазы служит перекись водорода, а хромогеном 5-аминосалициловая кислота и другие вещества.
В настоящее время в микробиологии используется твердофазная модификация ИФА. Ее суть заключается в том, что в начале на каком-либо твердом материале сорбируют аг (или ат) и лишь после этого добавляют остальные ингредиенты реакции.
Определение неизвестных аг состоит из следующих этапов:
1. Связывание ат, специфичных для искомого аг. С пластиком лунки планшета;
2. Внесение антигенсодержащего материала;
3. Внесение 2-х антител той же специфичности;
4. Внесение коъюгата (меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки);
5. Внесение хромогенного субстрата;
РИА. Аг илил ат для РИА метят радиоизотопом. Чаще всего 125I. Реакция РИА очень чувствительна, позволяет определить 1-2нг и меньше исследуемого материала.
Чаще всего применяется радиофазная модификация РИА (суть такая же, как и ИФА). Применяют три метода твердофазной РИА: конкурентный, обратный и непрямой.
При конкурентном методе на поверхности сорбента сорбируют известные ат. Затем в лунки вносят исследуемый аг и спустя определенное время, достаточное для специфического взаимодействия, добавляют меченый радиоизотопом очищенный аг той же специфичности.
Если в исследуемом материале содержится аг, соответствующий иммобилизированым ат, чатсь активных центров последних блокируется. В таком случае внесенный в лунки меченый аг будет в меньшей степени (в сравнении с контролем) соединяться с ат, о чем можно судить по радиоактивной жидкой части реагирующей смеси.
При проведении РИА обратным методом на поверхности лунок сорбируют очищенный немеченый аг, гомологичный исследуемому аг. В отдельной пробирке соединяют антигенсодержащий материал с меченвми ат, специфичными с аг, иммобилизированными в лунках. Если в исслудемомо материале модержится аг, способный взаимодействовать и мечеными ат, активные центры последних полностью или частично блокируются. В таком случае при внесении в лунки с аг смеси, меченые ат буду не полностью взаимодействовать с аг, о чем можно судить по степени радиоактивности жидкости в сравнении с контролем.
Наиболее удобным является непрямой метод РИА с использованием антивидовых меченых ат. Метод может использован для идентификации неизвестных аг и ат. В обоих случаях применят антивидовую сыворотку, содержащих ат против соответствующих гамма-глобулинов.
Для проведения этого метода на поверхности лунок сорбируют аг, а затем добавляют разведенную сыворотку больного. При наличии в ней соответствующих ат на поверхности лунок формируется комплекс ат-аг. При последующем введении в лунку антивидовой меченой сыворотки ат, содержащиеся в ней, адсорбируются на образовавшемся комлексе. Чем больше в сыворотке больного ат, тем больше удет связанной с поверхностью лунок радиоактивной метки.
15. Использование реакций Аг+Ат с мечеными компонентами (РИФ, ИФА, РИА) для обнаружения антител в сыворотке крови.
ИФА. Определение неизвестных ат включает несколько этапов:
1. Связывание известного аг с пластиком лунки планшета;
2. Внесение испытуемой сыворотки
3. Внесение конъюгата (меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки);
4. Внесение хромогенного субстрата;
Остальные реакции по сути такие же.
Дата добавления: 2018-09-20; просмотров: 469; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!