Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами
Белки при взаимодействии с концентрированными минеральными кислотами подвергаются необратимой денатурации и выпадают в осадок. В избытке серной и соляной кислот происходит постепенное растворение первоначально выпавших осадков. Избыток азотной кислоты практически не растворяет осадка белка, поэтому для обнаружения белка в исследуемом растворе пользуются азотной кислотой.
Опыт 7.В три пробирки наливают по 2 мл концентрированной азотной, серной и соляной кислот. Затем осторожно по стенке добавляют в каждую пробирку по 1-2 мл раствора яичного белка. Наблюдают образование осадков белков на границе двух жидкостей. При перемешивании осадки, образующиеся при действии соляной и серной кислот, растворяются, а в растворе азотной кислоты осадка образуется еще больше.
Осаждение белков органическими кислотами
Для осаждения белков часто используют органические кислоты, такие как сульфосалициловая и трихлоруксусная. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки и не осаждает продукты распада белков и свободные аминокислоты, поэтому ею часто пользуются для полного удаления белков из биологических жидкостей.
Опыт 8. В две пробирки наливают по 2 мл раствора белка и добавляют в первую несколько капель 20% раствора сульфосалициловой кислоты, а в другую – несколько капель 5% раствора трихлоруксусной кислоты. В обеих пробирках наблюдается образование осадков белка.
|
|
|
Осаждение белков солями тяжелых металлов
Соли тяжелых металлов вызывают необратимую денатурацию белков, образуя с ними нерастворимые в воде соединения. Но при избытке некоторых солей происходит растворение осадка за счет адсорбции ионов солей белковыми частицами. В результате белковые частицы приобретают заряд и вновь растворяются. Растворение осадков денатурированных белков в избытке солей тяжелых металлов называется адсорбционной пептизацией.
Способность белков образовывать с солями тяжелых металлов нерастворимые соединения используется при отравлениях этими солями, когда в качестве противоядия применяют молоко или яичный белок.
Опыт 9.В две пробирки наливают по 2 мл раствора белка. В одну добавляют несколько капель 10% раствора медного купороса, в другую – несколько капель 5% раствора ацетата свинца. В обеих пробирках белки денатурируют. При добавлении в пробирки избытка солей наблюдается растворение образующихся осадков.
Осаждение белков фенолом и формалином.
Опыт 10. Фенол и формалин вызывают необратимую денатурацию белков. В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка. В первую добавляют 1 мл насыщенного раствора фенола, а во вторую добавляют 1 мл раствора формалина. В пробирке, куда добавлен фенол, осадок образуется быстрее.
|
|
|
Осаждение белков спиртом
Опыт 11. Спирт вызывает дегидратацию молекул белка, вследствие чего происходит снижение устойчивости белковых молекул и денатурация белка. В пробирку наливают 2 мл раствора белка и осторожно по стенке пробирки наливают этиловый спирт так, чтобы он наслоился на белковый раствор. На границе двух жидкостей можно наблюдать белое кольцо денатурированного белка.
Оформление работы
Опыты с 1 по 6 приводят полностью с объяснениями, а результаты опытов с 7 по 11 можно оформить в виде таблицы, в которой в первой колонке указывают белок, который используется в опыте, во второй колонке указывается вещество, которое используется для осаждения, в третьей колонке описываются наблюдаемые изменения, в четвертой – дополнительные замечания.
Лабораторная работа № 3
Определение изоэлектрической точки казеина и желатина
Реактивы и оборудование: 0,1 М, 0,2 М и 1 М растворы уксусной кислоты, 0,4 % раствор казеина в 0,2 М растворе ацетата натрия, 0,1 М раствор ацетата натрия, 1% раствор желатина, 96% этанол или ацетон, штативы, пробирки, фотоэлектроколориметр, кюветы, пипетки на 5 и 10 мл.
|
|
|
Изоэлектрической точкой белка называется величина pH среды, при которой суммарный электрический заряд белка равен нулю. Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы, нейтральные молекулы белка легко выпадают в осадок. Вследствие этого определение изоэлектрической точки может быть сведено к определению pH раствора, при котором наблюдается наиболее полное и быстрое выпадение белка в осадок. Для получения растворов с различной величиной водородного показателя пользуются буферными растворами.
Опыт 1. Для определения изоэлектрической точки казеина в 7 сухих пробирок наливают последовательно реактивы в количествах (в мл), указанных в таблице 1.
Таблица 1
| № пробирок | Уксусная кислота, 0,2 М р-р, мл | Вода, мл | 0,4% р-р казеина в 0,2 М р-ре ацетата натрия, мл | рН смеси |
| 1 | 4,8 | 1,2 | 0,6 | 3,8 |
| 2 | 2,4 | 3,6 | 0,6 | 4,1 |
| 3 | 1,2 | 4,8 | 0,6 | 4,4 |
| 4 | 0,6 | 5,4 | 0,6 | 4,7 |
| 5 | 0,3 | 5,70 | 0,6 | 5,0 |
| 6 | 0,18 | 5,82 | 0,6 | 5,3 |
| 7 | 0,09 | 5,91 | 0,6 | 5,6 |
Растворы тщательно перемешивают. Казеин – гидрофобный белок, не имеет водной оболочки, менее устойчив и поэтому через 5-10 минут наблюдается помутнение растворов. Наибольшее помутнение наблюдается в той пробирке, где рН соответствует изоэлектрической точке казеина.
|
|
|
Если визуально определить пробирку с максимальным помутнением не удается, следует использовать фотоэлектроколориметр. С помощью фотоэлектроколориметра нужно провести определение процента пропускания света (Т%) приготовленными растворами, мутность которых объясняется образованием осадков белков в виде стабильной суспензии.
Для этого за 15-20 мин до работы включают прибор, в дальнее кюветное отделение ставят кювету с дистиллированной водой, а в ближнее отделение ставят кювету с анализируемым раствором. Сначала свет пропускают через воду, стрелку прибора с помощью грубой и тонкой регулировки ставят на 100% пропускания света. Потом против пучка света ставят кювету с анализируемым раствором, определяют и записывают показания стрелки прибора (процент пропускания света).
Аналогичным образом определяют % пропускания света во всех пробирках. Пробирка, в которой пропускание света будет минимальным, соответствует изоэлектрической точке белка.
Опыт 2. Для определения изоэлектрической точки желатина в 6 сухих пробирок последовательно наливают реактивы в количествах (в мл), указанных в таблице 2.
Содержимое каждой пробирки перемешивают и затем во все пробирки медленно по стенке добавляют по 2 мл 96% этанола (или ацетона). Желатин – белок гидрофильный, обладающий двумя факторами устойчивости: зарядом и водной оболочкой. Спирт понижает устойчивость белка.
Таблица 2
| № пробирки | Вода, мл | Уксусная кислота, 0,1 М р-р мл | Уксусная кислота, 1М р-р, мл | Ацетат натрия, 0,1 М р-р, мл | Желатин,1% р-р, мл | рН среды |
| 1 | 3,8 | 0,8 | - | 2,0 | 2,0 | 5,6 |
| 2 | 3,5 | 0,5 | - | 2,0 | 2,0 | 5,3 |
| 3 | 3,0 | 1,0 | - | 2,0 | 2,0 | 5,0 |
| 4 | 2,0 | 2,0 | - | 2,0 | 2,0 | 4,7 |
| 5 | - | 4,0 | - | 2,0 | 2,0 | 4,4 |
| 6 | 3,2 | - | 0,8 | 2,0 | 2,0 | 4,1 |
Через 30 минут определяют изоэлектрическую точку желатина. Она будет соответствовать рН пробирки с максимальной степенью помутнения. В случае, если визуально определить пробирку с максимальной степенью помутнения не удается, можно использовать фотоэлектроколориметр для определения процента пропускания света.
Оформление работы
Результаты опытов представляют на графиках, на которых по оси абсцисс откладывают значения рН, а по оси ординат откладывают обратные проценту пропускания света значения (1/Т). Максимум на графиках будет соответствовать изоэлектрической точке казеина и, соответственно, изоэлектрической точке желатина.
Дата добавления: 2018-05-13; просмотров: 3523; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!