ПОЛУЧЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ БИОТРАНСФОРМАЦИЕЙ
Существующие способы получения аминокислот методом биотрансформации можно разделить на три основные группы:
• ферментативное расщепление D-, L-аминокислот и их производных на оптически активные изомеры;
• прямой ферментативный синтез оптически активных аминокислот, протекающий без использования энергии АТФ и других макроэргических соединений;
• ферментативный синтез оптически активных соединений, протекающий с использованием живых клеток-продуцентов.
Ферментативное расщепление D-, L-аминокислот и их производных на оптически активные изомеры. Получение L-аминокислот ферментативным гидролизом иллюстрируют данные, представленные в таблице 23.5.
Ферментативный гидролиз N-ацетил-D,L-аминокислот — наиболее распространенный и хорошо изученный процесс получения L-аминокислот из их рацематов (рис. 23.3).
Этот способ интересен возможностью получения целого спектра аминокислот при условии замены сырья и использования одного и того же биокатализатора. В последние годы развитие ферментативного гидролиза N-ацетил-D -,L-аминокислот связано с созданием мембранных реакторов, позволяющих обеспечить длительное и эффективное использование фермента без его предварительной иммобилизации. Известны промышленные способы получения L-лизина и L-цистеина ферментативным гидролизом.
Ферментативный гидролиз эфиров D-,L-аминокислот также может быть использован для получения L-аминокислот. Так, гидролизом метиловых эфиров N-ацетил-D-,L-метионина, D-,L-фенилаланина и D-,L-триптофана с помощью эстераз можно получать соответствующие L-изомеры. Применение эстераз в мембранном реакторе эмульсионного типа позволяет реализовать непрерывное расщепление рацематов.
|
|
Несмотря на несомненные преимущества ферментативного расщепления оптических изомеров, связанные с его универсальностью, из-за необходимости дополнительной стадии рацемизации непрореагировавшей аминокислоты или ее производных такие процессы считают менее предпочтительными по сравнению с прямым ферментативным синтезом оптически активных аминокислот.
Прямой ферментативный синтез оптически активных аминокислот. Основные способы получения L-аминокислот методом ферментативного синтеза приведены в таблице 23.6.
В связи с производством дипептидного подсластителя аспартама интерес к получению L-аспарагиновой кислоты в последние годы возрос во многих странах.
В 1983 г. фирмой «Танабе Сейаку» (Япония) были получены мутантные штаммы Serratia marcescens и Escherichia coli с высокой аспартазной активностью.
В условиях биотрансформации при использовании целых клеток под действием фумаразы может происходить присоединение воды к фумаровой кислоте с образованием L-яблочной кислоты. Инкубация клеток при рН 4,5, температуре 45 °С в культуральной жидкости в присутствии 50 ммоль/дм3 L-аспарагиновой кислоты не только приводит к практически полной инактивации фумаразы, но и существенно (почти вдвое) увеличивает срок работы биокатализатора за счет инактивации протеаз. В настоящее время использование обработанных таким образом и иммобилизованных в каррагинане клеток Escherichia coli ЕАРс-7 в реакторе колонного типа позволяет производить до 100 т L-аспарагиновой кислоты в месяц.
|
|
В США предложены эффективные методы получения биокатализатора с аспартазной активностью иммобилизацией Escherichia coli ATCC 11303 в полиуретане и полиазетидине.
Другая лиаза (фенилаланинаммиаклиаза) используется для производства L-фенилаланина — второго компонента аспартама.
В этом процессе исходным веществом является ацетаминокоричная кислота, используемая в качестве предшественника фенилпировиноградной кислоты. Обнаружены штаммы, способные превращать относительно дешевую ацетаминокоричную кислоту в L-фенилаланин. Процесс идет в две стадии. На первой стадии ацетаминокоричная кислота превращается в фенилпировиноградную кислоту с помощью ацилазы, на второй — пиридоксалевый фермент в результате трансаминирования превращает фенилпировиноградную кислоту в L-фенилаланин (рис. 23.4).
|
|
При использовании 40 мг/см3 биомассы и 10 мг/см3 ацетаминокоричной кислоты выход фенилаланина составляет 94 % после 72 ч инкубации.
Ферментативный синтез оптически активных аминокислот с использованием живых клеток. Основные источники получения аминокислот биотрансформацией с использованием живых клеток представлены в таблице 23.7.
При получении аминокислот в ряде случаев используют метод введения предшественников в процессе ферментации. Так, L-лейцин и L-изолейцин могут быть получены с помощью Corynebac-terium glutamicum из а-кетоизокапроновой и а-кетомасляной кислот. В первом случае из 22 г/дм3 субстрата получается 24 г/дм3 лейцина, во втором из 200 моль/дм3 а-кетомасляной кислоты образуется 13 г/дм3 L-изолейцина. Последний может также быть получен при использовании иммобилизованных в каррагинане клеток. При этом в качестве предшественника используется D-треонин, а жизнедеятельность микроорганизмов поддерживается добавлением глюкозы в качестве энергетического субстрата и аэрацией.
|
|
Вместо D-треонина можно подавать в реакционную среду любой из промежуточных продуктов.
Ферментация с подпиткой предшественником используется при получении L-триптофана и L-серина. Так, триптофан может быть получен ферментацией с непрерывной подачей питательных веществ и индола или антраниловой кислоты.
Производство серина методом подпитки предшественником основано на использовании гетеротрофных и метилотрофных микроорганизмов. В первом случае используют глюкозу в качестве энергетического субстрата и глицин в качестве предшественника серина, во втором — соответственно метанол и глицин.
Аналогичным образом наличие в культуральной жидкости предшественника L-пролина L-глутаминовой кислоты позволяет получить в культуральной жидкости пролин. L-глутамин может быть получен из L-глутаминовой кислоты с помощью глутамин-синтетазы.
В 50-е годы XX в. японскими учеными был открыт вид микроорганизмов Corynebacterium glutamicum, обладающий способностью к сверхсинтезу глутаминовой кислоты. Углубленное изучение этой группы микроорганизмов показало, что при направленной селекции можно получить мутанты, обладающие также способностью к сверхсинтезу L-лизина. Поэтому большинство продуцентов L-лизина в настоящее время можно отнести к роду бактерий Согупеbacterium. Это открытие послужило основой создания крупнотоннажного производства L-аминокислот.
Известно, что синтез аминокислот в клетке ведется очень экономно и целенаправленно, под контролем специальных регулирующих систем. Регуляторный контроль обычно осуществляется по принципу обратной связи на уровне начального фермента или ферментов данного специфического пути образования метаболита. В случае значительного повышения уровня конечного продукта (например, L-лизина) включается механизм регуляции и один из ферментов в цепи последовательных превращений блокируется, синтез прекращается. Цель этого регулирования — предотвратить избыточное образование и накопление данного метаболита, потребность организма в котором в настоящий момент полностью удовлетворяется. Но такой безупречный ход синтеза возможен лишь у микроорганизмов, не имеющих нарушений и дефектов в этом механизме. В природных условиях такие нарушения достаточно редки, но все же встречаются. Например, найдено немало природных микроорганизмов, обладающих способностью к сверхсинтезу глутаминовой кислоты, аланина, валина. В то же время таких продуцентов по лизину, гомосерину, треонину и некоторым другим аминокислотам в природных условиях найдено не было. Для получения промышленных продуцентов пошли по пути получения мутантов, имеющих генетический дефект регуляторного контроля процесса биосинтеза этих аминокислот, а позднее использовали генномодифицированные микроорганизмы-продуценты. Очевидным преимуществом этого способа является то, что микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме, образование аминокислот в D-форме является редчайшим исключением. Это значительно облегчает очистку и выделение аминокислот.
В биотехнологическом производстве аминокислот в качестве сырья можно использовать как продукты химии и нефтехимии, так и отходы сельского хозяйства и других отраслей. Долгое время для получения аминокислот применяли исключительно углеводосодержащее сырье: глюкозу и гидролизаты крахмала. Использование свекловичной или тростниковой мелассы как основного для биосинтеза углеводного сырья, содержащего одновременно большое количество сахара и все необходимые факторы роста, доступного по цене и запасам во многих районах земного шара, позволило в 50-е годы XX в. организовать крупнотоннажное микробиологическое производство важнейших аминокислот. Несмотря на общее удорожание различных видов сырья, в том числе и мелассы, она по-прежнему остается одним из основных сырьевых ресурсов биотехнологических производств.
В 70-е годы XX в. для получения аминокислот комбинированным и микробиологическим методами стали широко применять продукты химии и нефтехимии, что позволило организовать крупномасштабное производство аминокислот для кормовых и пищевых целей. Применение химического сырья для биосинтеза обеспечивало возможность стандартизации процесса, повысило выход и упростило выделение аминокислот. Так, способы получения лизина и глутамата натрия из ацетатного сырья отличались высокими технологическими показателями (содержание аминокислоты в культуральной жидкости, выход готового продукта). Однако резкое увеличение цен на это сырье ограничило его применение для биосинтеза аминокислот.
Из нефтехимических источников сырья для биосинтеза аминокислот в настоящее время привлекают внимание спирты, в том числе этанол и метанол. Однако использование их сдерживает ряд технологических трудностей, и в первую очередь отсутствие высокопродуктивных микроорганизмов. Исследования в этом направлении продолжаются.
В последние годы возрастает роль дешевого растительного сырья для микробиологического производства аминокислот. В Японии, Китае и странах Юго-Восточной Азии работают предприятия по синтезу аминокислот генномодифицированными микроорганизмами, выращиваемыми на гидролизатах различных сельскохозяйственных культур.
Типовая схема технологического процесса получения аминокислот микробиологическим способом представлена на рисунке 23.5.
Создание и использование в рационе питания БАД, содержащих не только каротиноиды, но и убихиноны, полиненасыщенные жирные кислоты, некоторые фосфолипиды и витамины группы D, позволяют повысить уровень адаптационной защиты организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды и снизить риск развития злокачественных новообразований и ряда других опасных заболеваний. Доказательством этому служит все более пристальное внимание ученых многих индустриально развитых стран к этим биологически активным веществам липидной природы, и, как следствие этого, разработка и создание технологий, позволяющих получать каротиноиды, убихиноны, полиненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды и витамины группы D методами химического синтеза, экстракцией из животных и растительных тканей или биотехнологическими методами. Последние, по мнению большинства специалистов, являются наиболее перспективными.
Российскими специалистами предложены биотехнологические методы получения высших гомологов убихинона из липидов дрожжей рода Candida и из биомассы бактерий Gluconobacter. Для одновременного получения эргостерина и убихинона предложены способы использования дрожжей рода Candida и некоторых других микроорганизмов.
Сотрудниками ГосНИИсинтезбелок разработана технология комплексной переработки биомассы гриба Blakeslea trispora, позволяющая получать в едином технологическом процессе несколько ценных целевых продуктов: β-каротин, убихиноны, эргостерин, фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты. Принципиальная технологическая схема процесса представлена на рисунке 24.4.
Установлены следующие закономерности культивирования гриба BL trispora, обеспечивающие максимальное накопление отдельных компонентов биолипидного комплекса:
• максимальное накопление эргостерина отмечено на 65-й час совместной ферментации (+) и (—) штаммов, а максимальное накопление убихинонов — на 45-й час;
• внесение в среду культивирования сквалена оказывает положительное влияние на накопление убихинонов и эргостерина, в этом случае возможно получение биомассы с содержанием убихинонов 3,48 мг/г и эргостерина около 2 %;
• для получения стабильных водных растворов возможно использование смеси с содержанием убихинонов 40 %.
По сравнению с наиболее известными ранее разработанными схемами получения комплекса биологически активных веществ в технологическую схему внесены некоторые изменения, так, предложено:
• проведение процесса экстракции при температуре 55 °С в три ступени, на первой и второй ступенях использование в качестве экстрагента ацетона, на третьей —- этанола при соотношении биомасса: экстрагент 1:3,5; 1:2,0 и 1:1,5 на первой, второй и третьей ступенях соответственно. Время экстракции ацетоном — не более 30 мин, этанолом — 65 мин;
• использование на стадии кристаллизации β-каротина ацетона в качестве растворителя, проведение процесса при 55 °С в течение 18 ч при соотношении липиды: ацетон — 1:3, а процесса перекристаллизации — в этаноле при 20 °С и соотношении кристаллы : этанол 1:4;
• использование на стадии выделения фосфолипидов соотношения липиды: ацетон —1:5, проведение процесса в течение 20 мин при 10 °С;
• использование на стадии омыления при 67 °С в течение 50 мин в качестве среды смеси нейтральные липиды: ацетон: вода : гидроксид калия в соотношении 1:4,35:1,37:0,88;
• использование гексана на стадии экстракции неомыляемой фракции в качестве экстрагента, проведение экстракции в три ступени с соотношением фаз нейтральные липиды: ацетон: вода : гексан — 1:5,1:4,9:3,5;
• использование на стадии кристаллизации эргостерина из неомыляемой фракции гексана, проведение процесса кристаллизации при 20 °С и соотношении неомыляемая фракция: гексан 1:5. Проведение перед стадией кристаллизации дополнительной очистки неомыляемой фракции 10%-м раствором ацетона в гекса-
не, позволяющей увеличить чистоту кристаллов;
• использование на стадии кристаллизации убихинонов этанола при 20 °С и концентрации убихинонов в этаноле 10 %.
Разработанная технологическая схема позволяет получать из 100 кг сухой биомассы гриба Bl. trispora следующие продукты: β-каротин (2,5 кг), фосфолипиды (8,2 кг), жирные кислоты (36,2 кг), эргостерин (1,2 кг), суммарные убихиноны (0,5 кг). На основании частичной реализации предложенной технологической схемы в настоящее время выпускаются биологически активные добавки к пище «Липидовит» и «Кютенвит».
24.3. ВИТАМИН В12
Витамин В12 (цианокобаламин) — октаэдральный кобальтовый комплекс с шестью лигандами. Его основа — макрокольцо, образуемое четырьмя частично восстановленными пиррольными кольцами, связанными через N с атомом кобальта (Со). Пиррольные кольца несут три амидированных остатка уксусной кислоты и четыре амидированных остатка пропионовой кислоты.
Витамин В12 участвует в процессах кроветворения и в синтезе таких биологически активных веществ, как аминокислоты и нуклеиновые кислоты. Он также способен повышать использование организмом растительных белков, приближая их по пищевой ценности к животному белку.
Витамин В12 не содержится в продуктах растительного происхождения и в дрожжах. Главный его источник для человека — продукты животного происхождения, особенно печень и почки.
Витамин В12 синтезируют многие микроорганизмы, но промышленных продуцентов очень мало. К ним относятся: Pseudomonas denitriftcans (до 20 мг/дм3), представители родов Micromonospore (до 11,5 мг/дм3) и Rhodopseudomonas, а также Bacillus megaterium, Klebsiella pneumoniae, Bacillus pasteurii, Achromobacter cobalamini (до 2 мг/дм3). Наибольшее количество витамина В12 (до 60 мг/дм3) синтезируют пропионовокислые бактерии.
В нашей стране были созданы две различные биотехнологии получения витамина В12:
• для медицинских целей на основе глубинного культивирования пропионовокислых бактерий;
• для животноводства путем ферментационного выращивания метанообразующих бактерий.
Пропионовокислые бактерии выращивают в анаэробных условиях для накопления биомассы микроорганизмов, в конце культивирования осуществляют аэрирование культуральной жидкости и вносят предшественник — 5,6-диметилбензимидазол для увеличения выхода витамина В12, который находится в биомассе; культуральную жидкость сепарируют и из биомассы экстрагируют водой витамин. Раствор витамина подтитровывают, вводят стабилизаторы, удаляют белки, витамин сорбируют на ионообменных смолах, затем его элюируют, чистят и кристаллизуют. Получают витамин В12 в разных формах — CN- и оксикобаламин.
Есть и другие способы выделения и очистки витамина В12. Для медицинских целей выпускается витамин В12 в различных формах и часто с примесью фолиевой кислоты. Все коферментные формы кобаламина получают в темноте, так как они неустойчивы к действию света.
24.4. ЭРГОСТЕРИН И ВИТАМИН D2
Эргостерин (эргоста-5,7,22-триен-3-ол) — предшественник витаминов группы D, которые встречаются только в животных организмах. В растениях есть стеролы, которые по химической природе и биохимическим превращениям тесно связаны с витаминами группы D. Характерным представителем группы стеролов является эргостерин (эргостерол).
Один из самых перспективных источников эргостерина — дрожжи, содержащие его в количестве, составляющем 60—90% общей суммы дрожжевых стеринов. Абсолютное количество эргостерина составляет 0,5—10 % массы дрожжей.
Эргостерин в клетках дрожжей может быть в свободном виде и в виде эфиров жирных кислот. Наиболее богаты эргостеринами Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis, S. chevaliery, S. oviformis. Эргостерины синтезируют дрожжеподобные микроорганизмы Ere-mothecium ashbyii и Ashbyii gossypii.
Микроскопические грибы, например Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Newvspora, Carotocystis, Rhizoctonia, Dendrodochium и др. также синтезируют эргостерин. Стерины обнаружены и в бактериях, но в гораздо меньших количествах, чем в дрожжах.
Важным условием синтеза дрожжами эргостерина является интенсивное аэрирование культуры, а также высокий уровень источника углерода в среде при сравнительно низком содержании азота. Стимулирует биосинтез внесение в среду аскорбиновой кислоты и предварительно окисленной или облученной олеиновой кислоты, а также ряд других приемов.
На основе проведенных многочисленных исследований в РФ была разработана технология дрожжевых препаратов витамина D2.
При определенных режимах аэробного культивирования эргостерин накапливается в дрожжевых клетках в огромных количествах. Дрожжи разрушают, обрабатывают щелочью (стерины — неомыляемая часть липидов) и экстрагируют эргостерины органическими растворителями. Полученный экстракт концентрируют и осаждают эргостерин этанолом. Для получения витамина D2 эргостерин облучают ультрафиолетовым светом. Такой витамин D2 может быть использован в медицине и в качестве биологически активной добавки к пище.
ВИТАМИН С
Аскорбиновая кислота (витамин С) была выделена в 1932 г. из лимонного сока.
Аскорбиновая кислота — это лактон с молекулярной массой 176,13 Да. Существуют две активные формы: аскорбиновая кислота (АК) и дегидроаскорбиновая кислота (ДГАК).
Эти две формы аскорбиновой кислоты самым активным образом участвуют в растениях в ферментативных взаимопревращениях окисленного и восстановленного глютатиона.
Биологической активностью обладает L-аскорбиновая кислота, наибольшее количество которой содержится в шиповнике (10 мг/г) и в красном сладком перце (свыше 2,5 мг/г). Витамина С много также в незрелых грецких орехах, черной смородине, капусте, хвое и т. д.
Растения, большинство животных (частично млекопитающие, птицы низших порядков, амфибии, рептилии) сами синтезируют аскорбиновую кислоту. Организм человека не синтезирует витамин С и может получить его только с пищей.
Аскорбиновая кислота имеет очень важное значение для сохранения пищевых продуктов, применяется как антиоксидант.
Для массового потребления аскорбиновую кислоту обычно получают химическим синтезом, но один его этап более целесообразно вести с помощью ферментных систем микроорганизмов, для чего используют уксуснокислые бактерии рода Acetobacter.
Уксуснокислые бактерии окисляют сорбит в L-сорбозу, которая может далее полностью расходоваться на синтез L-аскорбиновой кислоты.
Процесс осуществляется по следующей схеме:
• сырье — глюкоза (D-форма) восстанавливается химическим путем в сорбит;
• уксуснокислые бактерии проводят отщепление водорода у С5-атома сорбита и превращают его в L-сорбозу;
• химическим путем происходит превращение L-сорбозы в аскорбиновую кислоту (рис. 24.5).
Культуры уксуснокислых бактерий способны трансформировать сорбит в сорбозу при высоких концентрациях его в реакционной смеси (25—35 %).
Трансформация осуществляется уксуснокислыми бактериями, растущими на питательной среде, состоящей их кукурузного и дрожжевого экстрактов, дрожжевого автолизата и витаминов группы В, при интенсивной аэрации.
За 25—30 ч выход сорбозы достигает 96—98 % при концентрации сорбита около 20 %. Затем в вакуум-аппаратах фильтрат концентрируют при 60 °С, после чего охлаждают, при этом выпадают кристаллы сорбозы и т. д. (см. рис. 24.5).
Витамин С можно полностью получать с помощью микроорганизмов, так как он в достаточно больших количествах синтезируется из глюкозы дрожжами Lipomyces starkeryi (до 214 мкг/г сырой биомассы), грибами родов Fusarium, Aspergillus и бактериями Streptococcus thermophilus.
Дата добавления: 2018-05-12; просмотров: 1547; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!