ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ ХИМИЧЕСКИМ СИНТЕЗОМ
Химический синтез позволяет использовать непищевое минеральное сырье, обеспечивает высокую концентрацию продукта и получение соединений любой возможной структуры.
Методом органического синтеза получают многие аминокислоты: D, L-метионин, глутаминовую кислоту, лизин, триптофан, треонин, глицин и др. Получение аминокислот методом органического синтеза — многостадийный процесс, требующий использования сложных реагентов и тщательной очистки продукта от нежелательных сопутствующих соединений. Недостаток этого способа — образование смеси D- и L-форм аминокислот, которые крайне трудно разделить. Кроме того, D-форма в подавляющем большинстве случаев является балластом, так как не усваивается животными и человеком, а D-формы некоторых аминокислот обладают токсическими свойствами. Но технологии химического синтеза аминокислот постоянно совершенствуются, изыскиваются новые более рациональные пути синтеза, разделения рацемических смесей, способы превращения D-формы в L-форму и т. д.
Себестоимость синтетических аминокислот постепенно снижается. В связи с этим появляется экономически оправданная возможность широкого использования синтетических аминокислот и их производных в различных отраслях пищевой промышленности и медицине.
Из химических методов синтеза аминокислот в промышленности наибольшее применение нашел метод, основанный на цианировании альдегидов, получаемых оксисинтезом. Модификация его (метод Букерера) позволяет увеличить выход конечного продукта и избежать формирования смолообразных продуктов самоконденсации альдегидов, которые усложняют выделение аминокислот из реакционных смесей. Благодаря повышенной селективности процесса аминокислоты получаются более чистыми. Таким способом из соответствующих альдегидов могут быть получены важнейшие аминокислоты: глицин, аланин, лейцин, глутамино-вая кислота, метионин. Для всех перечисленных аминокислот технология синтеза исходного сырья — оксиальдегидов — достаточно отработана и универсальна и широко применяется во всех промышленно развитых странах.
|
|
Наиболее перспективным методом разделения рацемических смесей аминокислот является способ получения L-аминокислот в мембранном реакторе с помощью ферментов, разработанный в ФРГ. Этот способ основан, с одной стороны, на растворимости ферментов, с другой — на размерах биополимера (каковым является фермент), во много раз превышающих молекулы аминокислот. При использовании подходящей ультрафильтрационной мембраны катализатор (нерастворимый в воде фермент) задерживается в непрерывнодействующем проточном биореакторе, а маленькие молекулы продукта (аминокислоты) покидают биореактор беспрепятственно, поэтому возможен непрерывный гомогенный катализ (рис. 23.1). Ферменты (ацилазы) обладают специфичностью к определенной оптической форме аминокислот: L-аминокислоты освобождаются из смеси путем стереоспецифического гидролиза, D-аминокислоты не реагируют.
|
|
Успешно разработаны и используются способы разделения рацематов аминокислот кристаллизационными и хроматографичес-кими методами.
ПОЛУЧЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ ИЗ БЕЛКОВЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ И АВТОЛИЗАТОВ
Для получения аминокислот могут быть использованы отходы мясоперерабатывающей промышленности (кератиновое сырье, кровь и т.д.), яичный белок, казеин молока, различные отходы переработки растений, содержащие белки (клейковина пшеницы, соевый шрот и т. д.), белки микроорганизмов (кормовые и пищевые дрожжи). При переработке этого сырья все аминокислоты переходят в гидролизат, и для выделения отдельных аминокислот требуется сложная многостадийная очистка. Кроме того, сырье весьма дефицитно и дорого, поэтому из-за высокой себестоимости получаемых этим способом аминокислот его применение ограничено.
|
|
Для гидролиза сырья используют кислоты, щелочи и ферменты. При кислотном гидролизе белков большая часть триптофана разрушается, цистеин окисляется до цистина, серии и треонин распадаются. При щелочном гидролизе триптофан сохраняется несколько лучше, но практически полностью разрушаются серин, аргинин и цистеин. При ферментативном гидролизе белков аминокислоты не разрушаются, но требуется сложная подготовка сырья: белок должен находиться в растворимой или другой легкодоступной форме. Гидролиз редко идет до конца, поскольку большинство протеолитических ферментов не проявляют сродства к разрыву всех пептидных связей в субстрате, поэтому в гидролизате накапливается сложная смесь аминокислот и пептидов различной молекулярной массы, кроме того, в гидролизатах остается сам фермент или продукты его частичного разрушения, что также осложняет процесс выделения из этой смеси аминокислот.
Несмотря на трудности получения отдельных аминокислот из гидролизатов, это все же весьма важный источник получения их в смеси.
В нашей стране подобным способом вырабатывают небольшие партии высокочистых аминокислот в основном для научных целей, а также автолизаты и ферментолизаты дрожжевых биомасс для пищевой промышленности.
|
|
В основе технологического автолиза дрожжей лежат процессы подавления роста клеток и активации цитоплазматических деполимераз. При блокировке роста автолиз клеточных стенок происходит слабо и значительная часть нерастворенного материала может быть отделена в конце процесса в виде крупных структурных фрагментов. Активация цитоплазматических деполимераз приводит к накоплению продуктов гидролиза белков и нуклеиновых кислот. За счет этого в заключительной фазе автолиза происходит снижение рН реакционной среды, стабилизация рН свидетельствует об окончании процесса. Широко применяемым методом контроля является также определение содержания свободного аминного азота, нарастающего в процессе протеолиза.
Технологический автолиз пекарских дрожжей проводят при температуре 45...50 °С в присутствии плазмолизирующих агентов: толуола, хлороформа, этанола, поваренной соли и др. В суспензии биомассы создают рН 5,5—6,5. В ходе автолиза чаще всего рН не регулируют: при естественном изменении рН чередуются оптимальные условия для действия различных деполимеризующих ферментов, что повышает эффективность процесса в целом. Содержание сухих веществ в суспензии может быть от 1 до 20 %, снижение концентрации биомассы в этих пределах приводит к интенсификации автолиза. Продолжительность автолиза составляет 15—30 ч, а после предварительной механической дезинтеграции биомассы — 5—6 ч.
Отечественными учеными разработан способ комплексной переработки биомассы пекарских дрожжей на основе автолиза 20%-й суспензии дрожжей в присутствии 13 % толуола. Продолжительность процесса при 45...50 С 15—20 ч. Последующее фракционирование автолизата включает отделение клеточных стенок дрожжей центрифугированием, обесцвечивание жидкой фазы автолизата, удаление нуклеиновых соединений и пептидов сорбцией на ионите ИА-1p в ОН ¯ -форме, сорбцию аминокислот из очищенного раствора предыдущей стадии на катеоните КУ-2×8 и их последующую элюцию раствором аммиака. Получаемая смесь аминокислот содержит все незаменимые и заменимые аминокислоты в соотношениях, характерных для высокопитательных белковых продуктов. Содержание свободных аминокислот составляет около 70 % белка автолизированной биомассы, около 25 % белка гидролизовано до низших пептидов (500—700 Да). По данной схеме из 50 кг дрожжей с влажностью 75 % получают 2—3 кг смеси аминокислот, 0,3—0,5 кг нуклеиновых компонентов и около 6 кг клеточных стенок, из которых можно выделить 35—45 г эргостерина.
При получении дрожжевых автолизатов и выделении из них продуктов пищевого и медицинского назначения вместо токсичного толуола в качестве мембранотропных агентов используют этанол, а также смеси карбоновой кислоты [например, пропионовой (0,4 %)] и этилацетата (1,5 %), обеспечивающие стерильность процесса и высокий выход целевых продуктов (L-аминокислот и пептидов). Из нетоксичных агентов лучшим активатором протеолитических ферментов является этилацетат при температуре 50...55 °С, а из нуклеазных — этанол при 60...65 °С.
Дрожжевой автолизат, содержащий смесь метаболитов, обладает способностью индуцировать автолиз интактной дрожжевой биомассы, что позволяет использовать его в качестве затравки при непрерывном процессе автолиза.
Проведение автолиза в присутствии ионов Са2+ и Mg2+ дает возможность получать автолизаты с пониженным содержанием меланоидных компонентов, которые применяются без предварительной очистки.
Скорость и эффективность автолиза зависят, с одной стороны, от физико-химических условий ведения процесса, селективно оптимальных для стадии как индукции автолиза, так и ферментативного гидролиза клеточных биополимеров. С другой стороны, эффективность саморастворения клеток зависит от количества и активности клеточных гидролаз. Как правило, интенсивная деструкция клеток микроорганизмов заканчивается через 4—6 ч в результате ингибирования деполимераз конечными продуктами реакций.
Поэтому наиболее важными для повышения эффективности автолиза являются проблемы стабилизации ферментов автолитического комплекса. Решение их позволило бы пролонгировать время интенсивного гидролиза клетки и расширить диапазоны физико-химических параметров каталитической активности гидролаз.
По данным исследований специалистов Института микробиологии РАН, интенсификацию процессов автолиза дрожжей Sacchammyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe можно вызвать внесением в подкисленные клеточные суспензии (рН 3—3,5) химического аналога аутоиндуктора автолиза — спиртового раствора олеиновой кислоты (С18: 1)в концентрациях 0,25—4 мкмоль/см3, оптимально — 1,12 мкмоль/см3 (объемная доля спирта в суспензии 2 об. %).
Подкислением суспензии воспроизводили естественные условия в развивающейся дрожжевой культуре и обеспечивали лучшую инкорпорацию молекул (С18: 1)в клеточные мембраны, что вызывало их дестабилизацию и индуцировало автолиз клеток. Суспензию дрожжевых клеток термостатировали при температуре 40...45 °С в течение 30 мин (стадия индукции). Затем рН суспензии доводили до 6,8—7,2 раствором NaOH, клетки термостатировали при температуре 50... 53 °С в течение 6—8 ч с подтитровкой суспензии до заданных значений рН 6,8—7,2 (стадия автолитического разрушения клеток). Достигаемая глубина гидролиза для дрожжевых суспензий обоих видов составила 42,2—43,5 % по результатам уменьшения массы сухих клеток (МСК), как указано в таблице 23.2.
Перспективным источником белка являются избыточные пивные дрожжи, выход которых составляет 0,1—0,2% массы пива, они могут быть также автолизированы по описанной схеме.
Лизис дрожжей с использованием ферментных препаратов и различных мультиэнзимных композиций предоставляет более широкие возможности для получения продуктов различного состава, чем автолиз. Применение ферментных препаратов специфического действия позволяет быстро удалить клеточную стенку и выделить из освободившихся протопластов продукты различной степени гидролиза в зависимости от целевого назначения. Для получения недеградированных цитоплазматических компонентов следует использовать биомассу с низкой автолитической активностью.
Способы получения препаратов глубокого расщепления основываются на сочетании автолиза дрожжей и их лизиса препаратами литического или протеолитического действия. Для активации протеолиза дрожжей используют растительные, животные и микробные протеазы, которые могут быть неспецифическими по отношению к дрожжевому белку, но в сочетании с автолитическими протеазами дрожжей дают хороший эффект. Например, Проназа Е, папаин, пепсин, Протосубтилин нейтральный в соотношении с изолированным белком пекарских дрожжей 1:1000 гидролизуют его не более чем на 4 %, а добавление этих препаратов в том же соотношении к белку автолизирующихся дрожжей через 5 ч после начала этого процесса позволяет спустя еще 1 ч получить глубину гидролиза белка 95 %. В контроле этот уровень достигается лишь после 20 ч автолиза.
Амилопроторизин, содержащий комплекс протеаз: α-амилазу, экзо-β-глюканазу, ксиланазу, эффективно воздействует на дрожжевую клетку, переводя макромолекулярные структуры клетки в мономеры. При этом ферменты препарата осуществляют не только растворение белков протоплазмы, но и глубокую деполимеризацию в результате синергического действия трудногидролизуемых полисахаридов клеточных стенок.
Оптимальная дозировка препарата для 6-часового гидролиза 15 ед. ПС/г дрожжей, при этом в растворимое состояние переводится 80% белка, высвобождается 48—52% аминокислот, образуется около 50 мг/г аминного азота и 11 % редуцирующих углеводов.
Во ВНИИПБТ исследовали степень гидролиза микробного белка различного происхождения и установили, что наиболее легко гидролизуемыми являются кормовые и остаточные пивные дрожжи. В результате воздействия Амилопроторизина на дрожжевой белок этих микроорганизмов образуется 60—61 % свободных аминокислот, а при гидролизе пекарских дрожжей — 41%.
Технологическая схема гидролиза дрожжевой биомассы Амилопроторизином с получением биологически активной аминокислотной добавки: Протамин А — сухой фугат и Протамин К — сухой ферментолизат, представлена на рисунке 23.2.
Биохимический состав опытных партий Протаминов А и К, полученных на основе ферментолиза биомассы пекарских и пивных дрожжей, представлен в таблице 23.3. Энзиматическому гидролизу была подвергнута большая часть белков клетки (76—81 %), при этом высвободилось 46—49 % аминокислот.
Содержание нуклеиновых кислот во всех препаратах Протамина в результате гидролиза дрожжевых клеток ферментативным комплексом препарата Амилопроторизин было снижено более чем в десять раз (с 5 % до 0,43 —0,41 %).
Препарат Протамин пищевой наряду с легкоусвояемыми продуктами гидролиза высокомолекулярных полимеров дрожжевой клетки (аминокислоты, редуцирующие углеводы) содержит богатый комплекс витаминов (табл. 23.4) и рекомендуется для введения в рецептуры новых продуктов питания с повышенной биологической ценностью.
С использованием препарата Лизосубтилин возможно получение белково-витаминного обогатителя пищи из гидролизных дрожжей рода Candida и дрожжей спиртового производства. Кормовые дрожжи с влажностью 75—90 % нагревают до температуры 46...50°С. Вносят Лизосубтилин в количестве 0,2—0,5% сухого вещества дрожжей, проводят гидролиз в течение 20—30 ч при постоянной температуре и перемешивании. Затем непрогидролизованные остатки клеток отделяют сепарацией, а жидкую фазу высушивают. Сухой продукт представляет собой порошок соломенно-желтого цвета с приятным запахом. Содержание аминного азота составляет 4,3 %, около половины аминогрупп принадлежит свободным аминокислотам, среди которых преобладают аланин, лизин, лейцин (соответственно 16,0, 15,7 и 12,4 %).
Дрожжи спиртового производства обладают заметной автолитической активностью, причем оптимальные условия автолиза и лизиса Лизосубтилином совпадают, что позволяет вести процесс при постоянных значениях рН и температуры (рН 6,3—6,8, температура 50...55°С). При дозе препарата 0,1 % АСБ дрожжей выход растворимых форм азота и углеводов возрастает в 2—2,5 раза (по сравнению с автолизом), через 6 ч в жидкую фазу ферментолизата переходит около половины азотистых соединений и треть углеводов. Выход аминного азота составляет около 3 % АСБ дрожжей.
Применение ферментных препаратов не снижает пищевой ценности и усвояемости высвобождаемого белка, аминокислот и редуцирующих веществ.
У нас в стране на основе автолиза прессованных хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae были разработаны аминокислотные препараты «Александрина» и «Элита» в виде растворов, паст и порошков. В состав препаратов входят аминокислоты, углеводы, витамины, макро- и микроэлементы биогенного происхождения, необходимые для жизнедеятельности человека. Добавки не обладают мутагенным действием, не содержат холестерина и усваиваются человеком на 90 %. Препараты добавляют в хлебобулочные и кондитерские изделия, безалкогольные напитки и овощные обеденные консервы, напитки, желе, продукты детского питания.
Специалистами российской фирмы «БИТРА» разработаны натуральные БАД серии «Нагипол», созданные на основе автолизатов пивных дрожжей.
Пищевая ценность и биологическая активность БАД «Нагипол» определяется содержанием сбалансированного комплекса 18 аминокислот (включая все восемь незаменимых), пептидов, витаминов группы В, витаминов Е, F, К и наиболее важных эссенциальных макро- и микроэлементов: фосфора, калия, магния, железа, цинка, меди, хрома и др.
При приеме БАД «Нагипол» суточная потребность организма во всех вышеперечисленных биогенных соединениях восполняется на 20—50 % и более.
Оценка эффективности БАД «Нагипол», проведенная в рамках программы медико-экологической реабилитации населения, проживающего на экологически неблагополучных территориях, совместно с ГНИЦ профилактической медицины Минздравсоцразвития РФ, показала, что в результате проведения 3—6-месячной профилактики при ежедневном приеме препаратов в рекомендуемой дозе среди детей и взрослых в 1,5—2 раза снизилась распространенность показателей алиментарных дефицитов: хронических атрофических нарушений, признаков вторичных иммунодефицитов, снизился уровень психоэмоционального напряжения.
Включение ферментолизатов в состав пищевых продуктов улучшает питательную ценность последних; задерживает их порчу; придает им желательную структуру, растворимость; способствует получению пенообразующих, свертывающих, эмульгирующих свойств; предупреждению нежелательных взаимодействий; удалению пороков вкуса, запаха, токсичных и ингибирующих веществ.
Дрожжевые ферментолизаты и автолизаты обладают способностью придавать пищевым продуктам привкус мяса (или усиливать такой вкус), поэтому их широко используют в пищевой промышленности для приготовления супов, соусов, подлив и приправ, а также для придания вкуса таким продуктам, как чипсы. С помощью белковых гидролизатов можно составлять низкокалорийные белковые рационы, обеспечивающие контролируемое уменьшение массы тела, не приводящие к каким-либо патологическим последствиям. Однако белковые гидролизаты имеют сравнительно ограниченное применение в пищевой промышленности, прежде всего из-за горького вкуса пептидов, образующихся в процессе гидролиза.
Российскими исследователями показана целесообразность применения иммобилизованных ферментов, например Протосубтилина, для гидролиза белкового сырья, а также пептидов неполных белковых гидролизатов с целью получения смеси L-аминокислот, не содержащей пептидов.
Полученные гидролизаты белков не обладают горьким вкусом, что является одной из важнейших характеристик белковых ферментативных гидролизатов для применения в питании человека.
Дата добавления: 2018-05-12; просмотров: 1617; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!