Вопрос 158. Культивирование вирусов
Поскольку вирусы не растут на искусственных питательных средах, а размножаются только внутриклеточно, нужно было найти простые и общедоступные методы их культивирования. Крупным достижением было предложение Р. Гуд- пасчура в 1932 г. использовать для культивирования вирусов куриные эмбрионы, в клетках которых успешно размножаются многие вирусы.
Для получения культур клеток, которые можно было бы использовать для выращивания вирусов, необходимо было решить четыре главных проблемы:
1) получить в необходимом количестве свободные (т. е. изолированные друг от друга) клетки; создать такие питательные среды и условия, в которых клетки могли бы активно размножаться;
2) обеспечить условия, при которых в культурах клеток не могли бы размножаться бактерии;
3) определить методы, с помощью которых можно было бы распознавать рост вируса в культуре клеток и идентифицировать его.
Все эти проблемы были решены. Для выделения изолированных, но жизнеспособных клеток из разрушенных тканей использовали обработку их слабым раствором трипсина, разрушающего межклеточные мостики. Для культивирования клеток были предложены различные среды, содержащие все необходимые для размножения клеток питательные вещества (аминокислоты, основания, витамины и др.), минеральные соли, имеющие оптимальную рН и т. д. К питательным средам добавляли индикатор, по изменению цвета которого можно было судить о метаболизме клеток и их размножении. Было установлено, что в качестве основы, на которой клетки размножаются и образуют монослой, может быть использовано хорошо обработанное стекло пробирок и колб.
|
|
|
Основной недостаток первично-трипсинизированных клеток заключается в том, что после нескольких пересевов они перестают размножаться. Поэтому предпочтением стали пользоваться культуры таких клеток, которые способны размножаться in vitro бесконечно долго. Такие перевиваемые культуры клеток получают из опухолевых тканей (HeLa, НЕр-2 и др.) или из мутантных клеток с полиплоидным набором хромосом. Однако опухолевые клетки нельзя применять для получения вакцин. Для этих целей используют только культуры таких клеток, которые не содержат никаких кон- таминантных вирусов и не обладают злокачественностью. Лучше всего этим требованиям отвечают культуры диплоидных клеток. Таким образом, для выделения чистых культур вирусов в настоящее время используют чаще всего заражение куриных эмбрионов, первично-трипсинизированных и перевиваемых культур клеток.
Широкое распространение получил предложенный в 1952 г. Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при температуре 37 °С. Через 48—96 ч выявляются пятна-бляшки. Они имеют диаметр 1—3 мм и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия вируса. Этот метод позволяет непосредственно обнаруживать рост вирусов.
|
|
|
Различают два механизма гибели клеток, вызываемой вирусами, — некроз и апоптоз. Некроз происходит из-за необратимых нарушений целостности клеточных мембран, апоптоз — вследствие фрагментации ядерной ДНК под действием клеточной эндонуклеазы. Установлено, что апоптоз играет важную роль в патогенезе инфекций, вызываемых рядом РНК-содержащих вирусов (ретровирусов, миксовирусов, альфавирусов, буньявирусов, пикорнавирусов, флавивирусов).
Цитопатическое действие вирусов может проявляться в виде следующих изменений:
1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (полиовирусы, вирусы Кок- саки и др.).
2. Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток (вирус гриппа, клещевого энцефалита и др.).
|
|
|
3. Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы).
4. Крупнозернистая равномерная деструкция клеток (вирус герпеса).
5. Симпластообразование (респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори и другие).
О росте вирусов в клетках можно судить также по поведению индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в желтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый. Некоторые вирусы, в частности вирус гриппа, обладают особыми рецепторами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютинацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации или гемадсорбции. Кроме того, для обнаружения вируса в культурах клеток могут быть использованы различные серологические реакции: преципитации в агаре, иммунофлуоресценции, РСК, ИФМ и пр., а также метод ДНК-зонда и заражение животных, чувствительных к данному вирусу.
Методы идентификации (типирования) вирусов
Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активности вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:
1) нейтрализация цитопатического действия;
2) нейтрализация реакции гемадсорбции;
3) изменение проявления цветной пробы;
4) задержка (торможение) реакции гемагглютинации;
5) нейтрализация в опытах на животных.
Кроме того, для идентификации вирусов применяют методы иммунофлуоресценции, ДНК-ДНК-(РНК-РНК)-гибридизации, а также ПЦР.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 310; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!