Лабораторная работа 7. Определение концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови
Срок жизни эритроцитов составляет порядка 110-120 дней. Затем они фагоцитируются, главным образом в селезёнке, а также в костном мозге и печени. Гем после высвобождения повторно не используется, его порфириновый цикл превращается в жёлчные пигменты, которые выводятся из организма. В результате распада гема в печени, селезёнке и костном мозге образуется красно-коричневый пигмент билирубин. Дальнейшие превращения билирубина происходят в печени. Так как в воде билирубин малорастворим, он транспортируется кровью в комплексе с альбумином. В печени альбумин отделяется, а билирубин путём взаимодействия с УДФ-глюкуроновой кислотой образует хорошо растворимый билирубин-диглюкуронид. С жёлчью билирубин-диглюкуронид переходит в кишечник, где бактериальные ферменты отщепляют глюкуроновую кислоту. Затем жёлчные пигменты выводятся с мочой и калом. При избыточном образовании или нарушения выведения жёлчных пигментов развивается состояние, которое называется желтухой. В организме здорового человека 75% приходится на неконьюгированный билирубин, связанный с альбумином. Его называют непрямым, так как окрашенные продукты с диазореактивом он образует только при добавлении спирта, который освобождает билирубин из комплекса с альбумином. Билирубин-диглюкуронид сразу образует окрашенные продукты с диазореактивом, поэтому называется прямым.
Принцип метода:в присутствии кофеинового реактива диазотированная сульфаниловая кислота образует с прямым и связанным (непрямым) билирубином азобилирубин розово-фиолетового цвета. Интенсивность окраски исследуемого раствора прямо пропорциональна концентрации общего билирубина в пробе. При отсутствии кофеинового реактива в реакцию вступает лишь прямой билирубин. По разнице между общим и прямым билирубином
|
|
|
определяют концентрацию непрямого (связанного) билирубина.
Материалы и реактивы:
1. Раствор сульфаниловой кислоты:
-сульфаниловая кислота – (25±1,2) мМ
- соляная кислота – (0,5±0,025) М
2. Кофеиновый реактив (концентрат):
- бензоат натрия – (),5±0,25) М
- ацетат натрия – (1,5±0,075) М
- кофеин – (50±1,5) г/л
3. Раствор нитрата натрия 350 ммоль/л
Ход работы:
Анализ проводят в соответствии со схемой, приведенной в таблице:
| Отмерять в пробирку, мм | Общий билирубин | Прямой билирубин | Холостая проба |
| Сыворотка | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Кофеиновый реактив | 1,75 | - | 1,75 |
| Физ. раствор | - | 1,75 | 0,25 |
| Диазосмесь | 0,25 | 0,25 | - |
| Для определения прямого билирубинафотометрирование следует проводить через (5-10) мин после добавления диазосмеси, так как при длительном действии в реакцию вступает связанный (непрямой) билирубин. | |||
| Для определения общего билирубинапробу для развития окраски. Выдержать 20 мин, после чего фотометрировать.При дальнейшей экспозиции окраска не изменяется. Оптическую плотность калибровочной (Екал.) и опытной пробы (Еопыт.) измерить против холостой пробы при 540 нм в кювете с длиной оптического пути 10 или 5 мм. |
Расчет концентрации билирубина провести по калибровочному графику. Для его построения использовать набор ”Билирубин-калибратор”.
|
|
|
| Показания ФЕКа | 0,02 | 0,04 | 0,06 | 0,08 | 0,10 | 0,12 | 0,14 | 0,16 | 0,18 | 0,20 |
| Содержание билирубина, мг/л | 3,8 | 7,6 | 11,4 | 15,2 | 19,0 | 22,8 | 22,6 | 30,2 | 34,0 | 37,6 |
Для определения концентрации непрямого билирубина из величины показателя общего билирубина вычитают величину показателя прямого билирубина.
Нормальная концентрация общего билирубина составляет 10-12 мг/л (1,7-20,5 мМ); из него 75 % приходиться на долю непрямого, а 25 % составляет прямой билирубин.
Клинико-диагностическое значение. Токсическое действие высоких концентраций билирубина в крови проявляется поражением ЦНС, появлением некротических участков в паренхиматозных органах, угнетением клеточного иммунитета, развитием анемии вследствие гемолиза эритроцитов. Важную роль в токсическом действии билирубина играет его фотосенсибилизирующее действие. Билирубин, как метаболит протопорфирина, способен переводить молекулярный кислород в активную, синглетную форму. Синглетный кислород разрушает любые клеточные структуры, окисляет липиды мембран, нуклеиновые кислоты, аминокислоты белков. Вследствие активации им перекисного окисления липидов и отщепления гликопротеидов, а также высокомолекулярных пептидов мембран, возникает гемолиз эритроцитов. Накопление в крови билирубина (выше чем 27, 36 – 34,20 мкМ) приводит к откладыванию его в тканях и появлению желтухи. В зависимости от причины возникновения выделяют несколько видов желтух.
|
|
|
При гемолитической желтухе печень не успевает связывать большое количество свободного билирубина, который образуется при усиленном гемолизе эритроцитов. В результате концентрация билирубина в плазме крови увеличивается до 90 – 100 мкМ за счёт свободного билирубина.
При паренхиматозной желтухе вследствие повреждения гепатоцитов снижается коньюгационная способность печени, синтез желчи, коньюгированный билирубин частично попадает в кровь. При этом в крови увеличивается содержание как связанного, так и прямого билирубина. Паренхиматозная желтуха возникает при жировом гепатозе, гепатите, циррозе печени.
|
|
|
При обтурационной желтухе происходит закупорка жёлчных протоков. Жёлчь переполняет их и попадает в кровь. Повышение концентрации билирубина в крови до 170 – 700 мкМ происходит за счёт связанного билирубина.
У новорожденных вследствие стерильности кишечника билирубин не превращается в производные, но активно всасывается в кровь, обуславливая гипербилирубинемию. Кроме того, у новорожденных часто наблюдают временную низкую активность билирубинглюкуронилтрансферазы, которая является причиной желтухи новорожденных, характеризующейся высоким содержанием в крови неконьюгированного билирубина.
Биохимия почек
Почки являются одним из основных органов, выделяющих окончательные продукты обмена веществ из организма. Функциональной единицей почек является нефрон, в котором происходят процессы фильтрации, реабсорбции и секреции.
Для исследования функционального состояния почек используют физиологические (проба Зимницкого, проба Фольгарда и др.) и биохимические (исследование крови на количество остаточного азота и его отдельных компонентов, геморенальные пробы – соотношение содержания отдельных веществ в крови и моче) методы.
Из 1200 мл крови, проходящей через клубочки почек за 1 мин, фильтруется около 120 мл плазмы. Для измерения скорости и объёма клубочковой фильтрации используют вещества, легко проникающие сквозь почечный фильтр, не подверженные метаболизму, не связывающиеся белками, не реабсорбирующиеся, легко и точно определяемые. С этой целью используют инулин (полисахарид фруктозы), клиренс которого в среднем составляет 120 мл/мин. Если клиренс любого вещества ниже этой величины, то часть его реабсорбируется в канальцах почек, например, для мочевины он составляет 70 мл/мин, а для глюкозы почти 0 (пороговое вещество; порог для глюкозы отвечает граничной концентрации 8,88-10 ммоль/л); если же он выше, то клиренс этого вещества осуществляется не только путем клубочковой фильтрации, но и путем канальцевой секреции.
Близким к инулиновому является клиренс эндогенного креатинина. С учетом относительной стабильности концентрации эндогенного креатинина в крови и его секреции из мочи, по нему определяют клубочковую фильтрацию креатинина (геморенальная проба). Клиренс креатинина составляет у мужчин 97-137 мл/мин, у женщин – 88-128 мл/мин.
Моча – это водный раствор, в котором содержаться различные вещества органического и неорганического происхождения. Всего за сутки с мочой выделяется около 60 г веществ: 35-45 г органических и 15-25 г минеральных. В моче выявлено около 150 химических ингредиентов.
Дата добавления: 2016-01-05; просмотров: 28; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!