Лабораторная работ 1. Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии
Аминокислоты являются аминопроизводными карбоновых кислот. Общие свойства аминокислот определяются наличием карбоксильной и аминогрупп, но и строением и свойствами органического радикала. Строение радикала каждой аминокислоты определяет их специфические свойства.
По структуре радикалы аминокислот можно разделить на алифатические (разветвленные и неразветвленные) и циклические. В каждой из этих групп можно выделить заряженные (положительно либо отрицательно) и незаряженные, полярные (содержат полярную функциональную группу) и неполярные (гидрофобные).
Принцип метода. Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из них является вода(полярная неподвижная фаза), другой — неполярный органический растворитель – бутанол, смешанный с водным раствором уксусной кислоты (подвижная фаза). Водная фаза неподвижна, так как вода сорбирована на инертном носителе—целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (в хроматографической камере) удерживает до 20—22% воды, оставаясь внешне сухой.
Чем больше растворимость аминокислоты в водной фазе и меньше — в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота по бумаге с органическим растворителем.
Определение фактора удерживания (retention factor) Rf. На хроматографическую бумагу в одну точку или по одной линии наносят исследуемую смесь аминокислот. Далее конец бумаги погружают в смесь растворителей, которая вследствие капиллярности бумаги постепенно всасывается в нее. По ходу передвижения подвижной фазы смесь аминокислот будет разделяться, причем те из них, которые лучше растворяются в органическом растворителе, продвигаются вдоль бумаги дальше, те же, которые лучше растворяются в воде, проделывают более короткий путь. Когда фронт растворителя начнет приближаться к другому краю бумаги, процесс прекращают, бумагу вынимают из камеры и высушивают. Затем хроматограмму проявляют реагентом, дающим с аминокислотами цветную реакцию (например, с нингидриновым реактивом).
|
|
|
Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде цветных пятен, расположенных на разных расстояниях от места нанесения исследуемой смеси. Расстояние от места нанесения исследуемого раствора до середины каждого пятна (а) и от места нанесения раствора до фронта растворителя (b) измеряют и вычисляют отношение а/b, которое и является величиной Rf.
Данный коэффициент в стандартных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и др.) является характерной величиной для каждого вещества (в данном случае аминокислоты) и может быть использован для идентификации различных веществ.
|
|
|
| Rf | ||
| Бутанол:укс.к-та:вода (12:3:5) | Фенол:этанол: вода (15:4:1) | ||
| Аланин | 0,30 | 0,41 | |
| Аргинин | 0,15 | 0,66 | |
| Аспарагин | 0,12 | 0,22 | |
| Аспарагиновая кислота | 0,23 | 0,06 | |
| Валин | 0,51 | 0,62 | |
| Гистидин | 0,22 | 0,44 | |
| Глицин | 0,23 | 0,26 | |
| Глутамин | 0,17 | 0,29 | |
| Глутаминовая кислота | 0,28 | 0,12 | |
| Изолейцин | 0,67 | 0,71 | |
| Лейцин | 0,70 | 0,73 | |
| Лизин | 0,12 | 0,57 | |
| Метионин | 0,50 | 0,62 | |
| Пролин | 0,34 | 0,75 | |
| Серин | 0,22 | 0,22 | |
| Тирозин | 0,45 | 0,43 | |
| Треонин | 0,26 | 0,33 | |
| Триптофан | 0,50 | 0,58 | |
| Фенилаланин | 0,60 | 0,72 | |
| Цистеин | 0,08 | 0,05 |
Разделение смеси 2-х аминокислот методом хроматографии на бумаге
В связи с тем, что стандартные условия опыта выдержать сложно, более надежным методом идентификации аминокислот является нанесение на хроматограмму «свидетелей» – стандартных растворов чистых аминокислот – и сравнение расположения пятен.
Количественное определение аминокислот, разделенных таким образом, проводится путем колориметрирования элюатов, полученных из вырезанных окрашенных участков хроматографической бумаги. Для каждой аминокислоты строится калибровочный график, отражающий зависимость оптической плотности окрашенных нингидрином растворов от ее концентрации.
|
|
|
Ход работы. Используются полоски хроматографической бумаги 12-15см длиной и 1,5 см шириной, через верхний конец которых протянута нитка длиной 15-20 см. На нижнем конце бумаги на расстоянии примерно 1 см от края сделать метку простым карандашом, куда стеклянной палочкой нанести каплю раствора, содержащего смесь аминокислот (диаметр пятна не более 0,5 см). Место нанесения слегка просушить.
На дно сахарной пробирки, не смачивая ее стенок, внести из пипетки 1 мл растворителя (смесь бутилового спирта, уксусной кислоты и воды в соотношении 12:3:5). Приготовленную полоску хроматографической бумаги опустить в пробирку, придерживая за нитку так, чтобы бумага погрузилась в растворитель на 2-3 мм, не касаясь стенок пробирки, и чтобы место нанесения аминокислот было выше уровня растворителя. Пробирку закрыть пробкой и поместить в термостат, нагретый до 35-40°С, на 1 час. После этого полоску вынуть, отметить фронт растворителя, слегка просушить и обработать красителем (0,1% раствор нингидрина в ацетоне). Хроматограмму проявить нагреванием при 100-110°С в течение 5-7 мин (над пламенем горелки). В результате в местах присутствия аминокислот появятся сине-фиолетовые пятна (нингидриновая реакция). Рассчитать значения Rf для каждой аминокислоты.В выводах указать, почему произошло разделение, какая из аминокислот прошла большее расстояние и почему.
|
|
|
Подходы к классификации аминокислот. Каждую аминокислоту можно охарактеризовать, используя различные классификационные принципы. Помимо классификации аминокислот по структуре радикала, полярности и заряду, аминокислоты делят в зависимости от пищевой ценности на заменимые (могут быть образованы в организме из других аминокислот или из безазотистых метаболитов) и незаменимые (в организме не образуются), в зависимости от их участия в синтезе белка – на протеиногенные (кодируемые и некодируемые) и непротеиногенные.
Например: серин – алифатическая неразветвленная незаряженная полярная аминокислота; заменимая; протеиногенная, кодируемая.
Дата добавления: 2016-01-05; просмотров: 168; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!