КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

 

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объе­динением invitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Ключевыми в этом определении являются слова «фрагмент ДНК» и «объединение invitro», что собственно и указывает на сущность генетической инженерии и на ее отличие от всех ос­тальных методов получения гибридных (или химерных) организ­мов, таких, как генетическая селекция, эмбриональная инжене­рия и т. д.

Мы уже говорили, что определенные фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использовани­ем ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фраг­менты как с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагмен­тов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

Сшивка по одноименным «липким» концам. Некоторые ре­стриктазы, например EcoRI, вносят в цепи ДНК симметрич­ные, расположенные наискось друг от друга разрывы на рав­ных расстояниях от центра сайта узнавания. Эти комплемен­тарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплемен­тарными или липкими концами.

Спаривание оснований происходит только между компле­ментарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы, об­разуемые EcoRI, не будут спариваться, например, с АГЦТ-концами, образуемыми HindIII. Но любые два фрагмен­та (независимо от их происхождения), образовавшиеся под дей­ствием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитиевыми участ­ками комплементарных нуклеотидов (рис. 3.4).

Однако после такого спаривания целостность двойной спи­рали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для их восстановления, т. е. сшива­ния, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функ­цию— сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при реп­ликации. Таким образом, лигаза завершает образование реком-бинантной ДНК. Впервые такие эксперименты были выполне­ны в 1972 г. (Берг, США), и было показано, что использование рестриктазы, дающей «липкие» концы, в сочетании с ДНК-ли-газой может послужить основой для создания общего метода рекомбинации.

 

165

 

Сшивка по «тупым» концам. Липкие концы абсолютно не­обходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы так­же могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам.

Однако липкие концы можно ферментативным путем присое­динить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого исполь­зуют фермент — концевую трансферазу из тимуса теленка, кото­рая присоединяет нуклеотиды к З'-концам цепей ДНК (рис. 3.5). Так, например, если к обоим З'-концам двуцепочечного фрагмен­та присоединить поли-дА, а к З'-концам другого фрагмента — поли-дТ, то при смешивании этих двух фрагментов между ком­плементарными одноцепочечными концами происходит спарива­ние. Для ковалентного соединения двух фрагментов используют ДНК-лигазу. Эти процедуры составляют основу для второго об­щего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.

При таком способе соединения между фрагментами встраиваются участки ААААА/ТТТТТ. Такие дополнительные последовательно­сти могут влиять на функции соединяемых молекул, и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия рестриктаз.

 

 

166

 

Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами.

В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, т. е.

некомплементарные друг другу липкие концы, при­меняют так называемые линкеры (или «переходни­
ки»). Линкеры — это хими­ческисинтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комби­нацию (рис. 3-6). Существу­ют большие наборы таких генных «переходников». Ес­тественно, что при исполь­зовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экс­прессии генетической ин­формации. Часто в середи­ну линкера помещают ка­кой-либо регуляторный генетический элемент, на­пример, промотор или уча­сток, связанный с рибосо­мой. В этом случае линке­ры не только обеспечивают объединение генов, но и

обусловливают их экспрессию. Существуют линкеры «тупой конец — липкий конец».

При необходимости липкие концы можно превратить в ту­пые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помо­щью фермента — эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы «застраивают», т. е. с помощью ДНК-полимеразы I на однонитиевых липких концах синтезируют вторую нить.

После того как ДНК сшита в пробирке, ее надо ввести в живые клетки, и тут возникает проблема вектора.

Векторные молекулы. Трансформация. Ключевой операци­ей в генетической инженерии является введение в клетку и ста­бильное поддержание генетической информации, содержащейся в рекомбинантных молекулах ДНК. Это достигается при помо­щи так называемых векторных молекул или векторов. Дело в том, что при обычном введении ДНК, например, в бактериаль­ную клетку она, как правило, подвергается атаке ферментов, которые разлагают ее на составные компоненты — нуклеотиды. В некоторых случаях ДНК «выживает» в клетке, однако в про­цессе деления клеток она не наследуется и теряется. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетиче­ского аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном (интегрироваться в хромосому) и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации.

Молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию, а может быть, и экс­прессию, называются векторными молекулами. Таким образом, векторы позволяют осуществить введение в клетку дополни­тельной генетической информации. В качестве векторов исполь­зуют, как правило, плазмиды, бактериофаги, мобильные эле­менты, вирусы животных. Первые плазмиды-векторы были вы­делены из бактерий; в последующем большинство векторов было сконструировано при помощи методов генетической инже­нерии в соответствии с задачами экспериментаторов.

К векторной молекуле предъявляются следующие основные требования:

1) она должна иметь область, чувствительную к определен­ной эндонуклеазе рестрикции, которая расщепляет вектор, как правило, в одном участке, превращая его кольцевую форму в линейную. К линейной ДНК «пришивают» ген или гены и за­тем снова замыкают ее в кольцо и рекомбинантную ДНК вво­дят в клетки;

2) вектор должен реплицироваться в определенных клетках. Репликация осуществляется посредством специфического уча-

 

168

стка ДНК-репликатора, где сосредоточен реплицирующий ап­парат клетки и начинается репликация;

3) в составе векторной молекулы должен быть маркерный ген, который после проникновения вектора в клетку придает ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора. Иными словами, вектор должен иметь селективный генетический при­знак. Часто в качестве селективных используют широко рас­пространенные в природе гены ферментов, модифицирующих антибиотики и инактивирующие их действие. Например, в при­сутствии гена β-лактамазы бактериальная клетка приобретает устойчивость к пенициллину и на среде с этим антибиотиком образует клон или колонию клеток, несущих данный ген; обыч­ные клетки на данной среде погибают. Значит, если вектор со­держит ген β-лактамазы, то при помощи среды с антибиотиком легко обнаруживаются клетки, содержащие его, т. е. «транс­формированные вектором».

Бактериальные плазмиды в качестве векторов для клони­рования. Основная масса клеточной ДНК бактерий содержится в хромосоме (в хромосоме Е. coli, например, 4 млн. пар нуклеотидов). Однако кроме хромосом бактерии содержат большое число очень маленьких кольцевых молекул ДНК длиной не­сколько тысяч пар оснований. Такие минихромосомы называют плазмидами. Как правило, плазмиды имеют в своем составе ге­ны устойчивости к антибиотикам. Эти гены находятся в плазмидах, а не в главной хромосоме, поскольку в этом случае они представлены гораздо большим числом копий. Высокая копий-ность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества ферментов, химически нейтрализующих антибиотики, что и обеспечивает устойчивость к последним.

Некоторые плазмиды, называемые эписомами, могут интег­рировать в главную хромосому и передаваться от одной бакте­рии к другой при конъюгации, когда копия «мужской» хромосо­мы переходит в «женскую» клетку. Такие плазмиды называют­ся трансмиссибельными, и они легко передают свои гены. Поскольку плазмидная ДНК значительно меньше хромосомной, ее довольно легко выделить в чистом виде. В присутствии ионов Са плазмиды легко поглощаются бактериями, которые их не содержали, и в клетках бактериального потомства можно обнаружить мноғо копий поглощенной плазмиды. Однако бак­териальная клетка обычно может содержать в своем составе плазмиды одного типа.

Число копий плазмиды в клетке может существенно варьи­ровать. Это зависит от генетических особенностей как клетки,

 

 

169

 

так и плазмиды. Плазмиды, находящиеся «под ослаблен­ным контролем», могут раз­ множаться до тех пор, пока их число не достигнет10—200 копий на клетку. Если же плазмида находится «под строгим контролем», она реплицируется с той же скоростью, что и главная хромосома. Такие плазмиды содержатся в клетке в одной или в нескольких копиях. Ес­тественно, что для клониро­вания рекомбинантных ДНК стараются     использовать

плазмиды первого типа.

В качестве вектора впер­вые плазмида была исполь­зована в 1973 г. Экспери­менты проводились с ма­ленькой плазмидой Е. colipSC 101, поскольку она со­держит только один сайт расщепления EcoR1 (рис. 3.7). Под действием фермен­та плазмида превращалась в линейную молекулу с лип­кими концами. Такую плаз-мидную ДНК смешивали в оптимальных концентрациях и отношениях с фрагмента­ми чужеродной ДНК, также обработанной EcoRI и имеющей такие же липкиеконцы. Фрагменты сшивали ферментом ДНК-лигазой из фага Т4. В результате получились новые гибридные плазмиды, со­держащие в своем составе фрагменты чужеродной ДНК. Затем бактериальные клетки трансформировали гибридными плазми-дами и по способности расти в присутствии антибиотика отби­рали клоны, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК. Стало ясно, что можно проводить дальнейшие эксперименты, в которых эти плазмиды будут встраиваться в самые разнооб­разные чужеродные ДНК, происходящие как из микробов, так

170

 

и из тканей высших растений и животных. Хромосома Е. coliсодержит, например, около 500 сайтов для EcoRI. За счет слу­чайного встраивания EcoRI фрагментов в векторную молекулу можно клонировать все гены Е. coliв виде фрагментов. Эти фрагменты легко выделить, обработав выделенные клоны гиб­ридных плазмид той же рестриктазой и разделив плазмиду и хромосомные фрагменты с помощью электрофореза. Затем их легко извлечь из геля и использовать для генетических и биохи­мических исследований.

В зависимости от задач исследователей векторы условно можно разделить на два класса: 1) обычные векторы клониро­вания, при помощи которых из набора генов выделяют гены, размножающиеся в достаточных количествах для последующе­го изучения; 2) специализированные векторы для получения клонотек генов и для экспрессии генов.

Из класса обычных векторов, как мы уже говорили, в на­чальный период развития генетической инженерии наиболее широко использовали плазмиды hSC 101 и ColEI, выделенные из Е. coli . Большинство последующих плазмид конструировали на основе CoiEl, которая отличается способностью к накопле­нию значительных количеств плазмидной ДНК.

Плазмидные векторы в присутствии хлорамфеникола могут умножаться независимо от деления хромосомы, и число копий плазмиды может многократно увеличиваться, достигая (10—20)* 10² копий на клетку. Использование векторов общего назначения методически не сложно, так как не требует специ­ального оборудования, и в связи с этим они получили широкое распространение во многих лабораториях мира. Одна из наибо­лее часто употребимых плазмид для клонирования HBR 322 создана на основе плазмид природного происхождения, выде­ленных из Е. coli(рис. 3.8). Эта плазмида содержит гены ус­тойчивости к двум антибиотикам: ампициллину и тетрацикли­ну, причем в генах устойчивости к этим антибиотикам имеются сайты рестрикции. Если фрагмент чужеродной ДНК встраива­ется в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужерод­ной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезно­вению у бактерий устойчивости к данному антибиотику. Но при этом сохраняется устойчивость к другому антибиотику. Таким образом вектор дает возможность детектировать только те кло­ны бактерий, которые содержат рекомбинантную плазмиду.

Создание рекомбинантных молекул дало возможность ана­лиза ДНК растений и животных. Теперь путем случайного

171

 

встраивания множества рестрикционных фрагмен­тов ДНК в подходящие бактериальные плазмиды (эта процедура была на­звана «методом дробови­ка») можно с большой ве­роятностью получить клон, содержащий интересую­щий нас ген или ка­кую-либо регуляторную последовательность. При этом нужно уметь из мно­жества клонов отобрать интересующий исследова­теля.

Библиотека генов. Фа­
говые векторы. Космиды.«Метод дробовика» дает возможность получать                                    получать

библиотеки (или клонотеки) генов с целью выделе­ния хромосомных генов. Оказалось, что гены эукариот занимают достаточно протяженные участкиДНК (до 10 тыс. нуклеотидных пар и более). Кроме того, для изучения регуляторных последовательностей, находящихся за пределами кодирующей части генов, необходимо клонировать еще более протяженные области генома. Оказалось, что для клонирования таких фрагментов плазмидные векторы не подхо­дят. Дело в том, что плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК, нестабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размере в результате делеции все большего числа нуклеотидов чужеродной ДНК- Значит, при создании библиотеки емкость вектора играет существенную роль.

На основе бактериофага были сконструированы векторы, в составе которых фрагменты ДНК длиной до 20 тыс. н. п. весьма стабильны, т. е. их емкость достигает 20 килобаз (1 килобаз — 1000 нуклеотидных пар). При создании таких векторов учитыва­лось то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага не нужна для репликации в Е. coli . Эту область с помощью рестриктазы вырезают из генома фага так, что правый и левый концевые фрагменты, необходимые для репликации, ос-

 

172

 

таются интактными. Концевые фрагменты отделяют от остальных фрагментов и используют для получения новых — подобных фа­гов, содержащих на месте вырезанной фаговой ДНК вставку чу­жеродной ДНК размером около 15 кб.

Для созревания фаговой частицы ее хромосома должна иметь длину около 45 кб. Это обстоятельство оказалось весьма удобным при отборе рекомбинантных фагов. Размножаются только те фаги, которые содержат оба конца фаговой хромосо­мы и вставку чужеродной ДНК подходящей длины (15—20 кб) (рис. 3.9). Фрагменты чужеродной ДНК получают ферментиро-ванием высокополимерной хромосомной ДНК при помощи ре-стриктаз. Рестриктазу и режим обработки ДНК подбирают та­ким образом, чтобы размер полученных фрагментов приблизи­тельно соответствовал емкости вектора. Полный гаплоидный набор хромосом клетки млекопитающего содержит около 3* 10 пар оснований. При емкости вектора 15 кб проверка миллиона фаговых бляшек позволяет проверить весь геном на присутст­вие данного гена. Но для этого нужно иметь соответствующий «зонд» (см. далее).

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к.ним последовательно­стями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—40 кб). Такой емкостью обладают плазмиды-космиды, содержащие cos-участок генома фага, участвующий в упа-

 

173

 

ковке ДНК в фаговую частицу на конечной стадии развития. Как оказалось, для упаковки ДНК необходимо, чтобы ДНК со­держала cos-участок и размер ее должен быть примерно рав­ным размеру генома фага (около 45 кб). Следовательно, к кос-миде можно пришить клонируемую ДНК значительных разме­ров (30—40 кб). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться, как фаги. Ими с весьма высокой эффективностью трансформируют клетки Е. coli . Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную cos-сайтами, размножается в Е. coliкак плазми-да, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта. Использова­ние космид позволяет получать клонетки практически любых организмов, ограничиваясь не более 2—5*10⁵ клонами. Геном­ные библиотеки используют для выделения генов.

 

ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОВ

 

Выделение генов — один из главных этапов в генетической инженерии. Успех на этой стадии создания рекомбинантных ДНК зависит прежде всего от следующих факторов: насколько изучен данный ген и его положение в геноме донора; от разра­ботки методов выделения мРНК данного гена и методов обна­ружения функциональной активности продукта данного гена; существования объектов, в которых данный ген находится в больших количествах (амплифицирован) или в которых он осо­бенно активен, что позволяет выделить достаточные количества его мРНК, которые можно использовать для получения ДНК этого гена путем обратной транскрипции. В принципе сущест­вуют два основных пути получения гена: либо ген синтезируют, либо из клонотеки отбирают ту рекомбинантную ДНК, которая содержит нужный ген.

Синтез комплементарной ДНК (кДНК). Осуществление первого пути стало возможным вследствие открытия фермен­та — обратной транскриптазы, или ревертазы. Этот фермент был выделен из некоторых РНК-содержащих онкогенных виру­сов. Фермент осуществляет РНК-направляемый синтез ДНК, т. е. на молекуле РНК, как на матрице, синтезируется компле­ментарная цепь ДНК- Отсюда и название фермента — он ката­лизирует реакцию, обратную первому этапу экспрессии ге­на — транскрипции.

Предположим, что нам удалось выделить гомогенный пре­парат мРНК, специфичной для определенного гена. В некото-

 

 

174

 

рых случаях, когда эта мРНК составляет суще­ственную часть тоталь­ной мРНК, это удается. Эукариотические мРНК, как правило, содержат на своем 3'-конце после­довательность, состоя­щую из остатков аденина — поли (А) последова­тельность. Для начала реакции ферменту нужна затравка в виде неболь­шого отрезка двуцепочеч-ной ДНК. Если смешать короткие олигонуклеотиды, состоящие из остатка тимина (олиго-дТ), они будут гибридизоваться с поли(А) последовательно­стью, и такой дуплекс будет служить затравкой для начала ферментатив­ной реакции. В результате образуется гибридная РНК—ДНК-молекула, причем на кон­це у нее будет короткий отрезок двуцепочечной ДНК — шпиль­ка. Она может служить затравкой для синтеза второй цепи ДНК, который осуществляет фермент ДНК-полимераза I (рис. 3.10). С помощью эндонуклеазы SI, которая специфически гид-ролизует одноцепочечные участки ДНК, шпильку можно рас­щепить. В результате получится двуцепочечная молекула ДНК с одной из нитей комплементарной мРНК. Такую ДНК называ­ют кДНК, и она соответствует структурному гену, с которого транскрибировалась исходная молекула мРНК.

К полученной кДНК пристраивают липкие концы (см. рис. 3.4) и встраивают в плазмиду, например pBR322. Рекомби­нантную ДНК вводят в Е. coli , где кДНК размножается. По­добная схема была использована для получения генов, коди­рующих инсулин, гормон роста, интерферон, глобин, альбумин, иммуноглобулины и ряд других белков, производство которых уже налажено микробиологической промышленностью.

Для того чтобы убедиться, что получен именно тот ген, кото­рый требовался, существует несколько приемов. Если известна последовательность аминокислот белка, кодируемого геном, то,

175

 

определив нуклеотидную последовательность клонированной ДНК одним из методов секвенирования (см. рис. 3.3), можно убедиться, что она кодирует именно этот белок. Иногда приме­няют метод ДНК — РНК, гибридизации. Это возможно в том случае, если выделена индивидуальная мРНК (рис. 3.11). Моле­кулы кДНК подвергают денатурации (при этом нити ДНК рас­ходятся) и смешивают с избытком мРНК. В условиях ренатурации (это процесс, обратный денатурации, при котором происхо­дит восстановление двойной спирали, причем последняя может образоваться как из двух цепей ДНК, так и из цепи ДНК и комплементарной ей цепи РНК) будет происходить образование

176

 

гибридных ДНК — РНК-молекул. С помощью эндонуклеазы SI можно убедиться в их полной комплементарности, а значит, и в том, что получен именно тот ген. Если ДНК не полностью ком­плементарна РНК, то в гибридной молекуле будут одноцепочечные неспаренные участки, которые будут гидролизованы эндонуклеазой SI. Более простой вариант этого метода состоит в том, что в реакции гибридизации участвует суммарная, а не ин­дивидуальная мРНК. В результате гибридизации с кДНК инди­видуальная мРНК окажется в составе гибридных молекул. То­гда эта мРНК не сможет направлять синтез полипептидов в бесклеточной белоксинтезирующей системе, и по отсутствию со­путствующей белковой полосы после разделения электрофоре­зом можно убедиться в соответствии гена мРНК.

Если кДНК в составе векторной молекулы способна к экс­прессии, т. е. на ней синтезируется мРНК, а затем белок, то ген можно идентифицировать по его продукту с помощью спе­цифического иммунохимического метода обнаружения белка. Таким образом, используя один из этих методов или их комби­нацию, можно убедительно доказать, что получен именно нуж­ный ген.

Мы рассмотрели случай, когда удалось выделить индивиду­альную мРНК. Это возможно, если ген избирательно активен в определенных клетках и тканях. В этом случае реакцию обрат­ной транскрипции проводят со смешанной популяцией мРНК и в результате получают кДНК, представляющую смесь обрат­ных транскриптов со всех типов мРНК.

Создание банка кДНК. Теперь задача сводится к выбору из популяции молекул кДНК тех обратных транскриптов, кото­рые представляют искомый ген. Чаще всего в этом случае при­бегают к методу создания банка кДНК. Для этого с помощью линкеров молекулы кДНК сшивают с векторными молекулами и трансформируют ими бактериальные клетки. Причем опыт строится таким образом, что каждая бактериальная клетка по­лучает только одну рекомбинантную плазмиду. В результате каждая бактериальная колония будет содержать только один вид кДНК. Далее отбирают единичные колонии и выращивают из них большие гомогенные культуры. Из клеток выделяют плазмиды, имеющие вид вставок кДНК. Плазмидную ДНК де­натурируют (при этом нити ДНК расходятся), и денатуриро­ванную ДНК необратимо связывают (иммобилизуют) с нитро-целлюлозными фильтрами. Через фильтр пропускают исходную смесь мРНК, и те молекулы мРНК, которые комплементарны данной кДНК, в результате ренатурации связываются с фильт-

 

 

177

 

ром. Таким образом, из смеси молекул мРНК можно выделить любую их фракцию (рис. 3.12).

Связавшуюся с фильтром мРНК можно элюировать (смыть) с фильтра и добавить к бесклеточной системе трансляции. Если при этом будет синтезироваться нужный белок, значит, данный бактериальный клон содержит в своих плазмидах искомый ген. Следует отметить, что чем представительней в популяции моле­кул мРНК транскрипты с искомого гена, тем легче его выде­лить описанным выше методом.

. Другой прием — иммунный скрининг колоний, т. е. поиски клона, который синтезирует нужный белок с помощью радиоак­тивных антител к нему. Этот метод осуществим в том случае, ко­гда ген экспрессируется в составе рекомбинантной плазмиды.

Выбор нужного гена из клонотеки — второй из наиболее распространенных способов получения гена. В этом случае за­дача исследователя сводится к поиску среди миллионов бакте­рий тех, которые содержат фрагмент ДНК с интересующим его геном. В настоящее время для решения такой задачи применя­ются молекулярные, зонды (пробы). Зонд представляет собой меченую молекулу нуклеиновой кислоты или белка, имеющую сродство к самому гену или его продукту, соответственно.

Индивидуальная радиоактивно меченая- мРНК служит хо­рошим зондом для выявления бактериальных колоний, несущих искомый ген. Однако, как мы уже отмечали, индивидуальную мРНК в чистом виде удается выделить в ограниченном числе

178

 

случаев, как правило, в специализированных клетках, где дан­ная мРНК синтезируется в значительных количествах. Напри­мер, в предшественниках эритроцитов больше половины всей мРНК представлено глобиновой мРНК.

В других случаях для выделения зонда прибегают к созда­нию банка кДНК, кодирующую данный белок, даже в условиях тысячекратного избытка других молекул мРНК, присутствую­щих в той же клетке.

Иногда продукт (а значит, и мРНК) искомого гена присутст­вует в клетке в столь мизерном количестве, что получить инди­видуальную РНК не удается. Тогда можно выделить небольшое количество чистого белка и определить аминокислотную после­довательность некоторой его части (обычно достаточно знания участка белковой молекулы длиной 5—6 аминокислотных остат­ков). По известной аминокислотной последовательности можно установить все возможные последовательности нуклеотидов в том участке мРНК, который кодирует данную аминокислотную последовательность. Затем из отдельных радиоактивно меченых нуклеотидов химически синтезируют олигонуклеотиды длиной не менее 16 звеньев, один из которых полностью комплементарен участку искомого гена. Такие нуклеотиды и являются пробами для поисков нужных клонов к ДНК.

После того как радиоактивный зонд получен, проводят ска­нирование геномной библиотеки или библиотеки кДНК, которое заключается в идентификации бактериальных колоний, содер­жащих плазмиду с последовательностью, комплементарной зон­ду. На чашку Петри с бактериальными колониями накладывают лист нитроцеллюлозы; на него переходит часть бактерий с каж­дой колонии, тогда как другая часть остается на чашке. В ре­зультате и на чашке, и на фильтре колонии распределены оди­наково. Для лизиса бактерий и денатурации ДНК нитроцеллюлозный фильтр обрабатывают NaOH, после чего прогревают его в вакуумной печи. В результате денатурированная ДНК прочно связывается с нитроцеллюлозой. Затем целлюлозу помещают в раствор, содержащий меченую кДНК или мРНК или синтетиче­ский олигонуклеотид. В условиях гибридизации метка связыва­ется с теми колониями, которые содержат последовательности, комплементарные зонду. Фильтр отмывают от несвязавшихся молекул и проводят радиоавтографию, которая и выявляет коло­нии, содержащие метку. Эти колонии идентифицируют на чашке Петри, отбирают и размножают.

Возможность выделения чистого белка позволяет осущест­вить и другой подход, основанный на получении антител против белка, ген которого требуется клонировать. При использовании

 

179

 

векторов на основе бактериофагов бактерии, зараженные фа­гом, содержащим искомый ген, в небольшом количестве синте­зируют кодируемый им белок. Поэтому библиотеку фагов мож­но просмотреть, используя препарат соответствующих антител, которые связываются с белком и тем самым позволяют иденти­фицировать клон с нужным геном. Скриннинг библиотеки осу­ществляется так же, как показано на рис. 3.13, с той разницей, что вместо меченой мРНК используются меченые антитела, ко­торые также можно идентифицировать с помощью радиоавто­графии. Этот же метод используется и при клонировании ДНК в экспрессируемых векторах (см. ниже).

Блот-гибридизация. При создании клонотек генов хромо­сомная ДНК. фрагментируется с помощью рестриктаз. При этом неизвестно, содержат ли искомый ген сайт (или сайты) расщепления данной рестриктазой. Если такие сайты присутст­вуют, то выделить целый ген не удастся, и нужно использовать другую рестриктазу. Однако еще предварительно, без клониро­вания в бактериях можно исследовать структуру индивидуаль­ных генов, определить наличие в них тех или иных сайтов рест­рикции, установить число копий данного гена в геноме. Метод блот-гибридизации, используемый для этих целей, требует на­личия соответствующей мРНК или кДНК.

 

180

        

        

    Анализ проводят следующим образом (рис. 3.14). Высокомоле­кулярную хромосомную ДНК расщепляют рест­ риктазой или их набо­ром. Образовавшиеся фрагменты разделяют по длинам электрофоре­зом в агарозном геле, и гель помещают на лист
нитроцеллюлозы. После этого направление элек­трофореза меняется на перпендикулярное (в направлении листа). При этом ДНК из геля переходит на нитроцел­люлозу и получается
как бы реплика с геля. Затем проводят гибри­дизацию на фильтре фрагментов хромосом­ной ДНК с зондом.
Зонд гибридизуетсятолько с теми фрагмен­тами (полосами), которые содержат соответствующий ему ген. Полосы, с которыми связывалась метка, вы­являют радиоавтографией.

Наличие на автографе одной полосы свидетельствует о том, что при реакции рестрикции ген не расщепляется, а интенсив­ность полосы дает возможность определить число копий гена в геноме. Таким образом, описанный метод может оказаться очень полезным для анализа гена или семейства генов с целью .выбора оптимальной стратегии клонирования.

Аналогичный метод разработан для анализа клеточных мРНК с целью выяснения их полного или частичного соответст­вия зонду, а также для определения их числа. Метод называет­ся «Северный блотинг». Здесь электрофорез проводят не с фрагментами ДНК, а с молекулами РНК, которые в присутст­вии формальдегида также разделяются по размерам, а потом гибридизуются с зондом. Метод является полезным дополнени-

 

 

181

 

ем к технике клонирования ДНК, так как позволяет определить степень соответствия специфической ДНК зонду.

Итак, в совокупности описанные методы в том или ином со­четании позволяют получить практически любой ген, продукт которого — белок — известен и может быть выделен хотя бы в малом количестве. Этот ген в дальнейшем может стать объек­том генно-инженерных манипуляций, задача которых получить его экспрессию в новом генетическом окружении.

 

 

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

 

---

Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 552; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!