УЛУЧШЕНИЕ КАЧЕСТВА ЗЕРНА МЕТОДАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Одной из основных задач улучшения растений является повышение качества синтезируемых продуктов: белков, жиров, полисахаридов и других веществ, определяющих питательную и техническую ценность.
У злаков наибольший интерес представляют белки, запасаемые в эндосперме. Запасные белки, в основном, кодируются несколькими сходными по своей структуре и по нуклеотидному составу генами, объединяемые в мультигенные семейства. Обычно экспрессия этих генов строго тканеспецифична и происходит на определенной стадии развития семени. В большинстве случаев запасные белки имеют несбалансированный для питания человека и животных аминокислотный состав. Так, запасные белки бобовых — легумины — характеризуются низким уровнем аминокислоты метионина, а запасные белки злаков — проламины — бедны лизином, триптофаном и треонином. Дефицит этих аминокислот снижает питательную и кормовую ценность семян.
Улучшение аминокислотного состава белка методами традиционной селекции довольно затруднительно в связи с тем, что гены, определяющие важные сельскохозяйственные признаки, часто бывают сцеплены и, следовательно, наследуются вместе с нежелательными признаками. Так использование в селекции кукурузы и ячменя мутантов типа опак-2, хайпроли, имеющих относительно высокое содержание лизина в зерне, не привело к значительному улучшению качества, так как у мутантных форм повышенное содержание лизина коррелировало с уменьшением синтеза основных запасных белков зеина и гордеина и, в конечном итоге, с уменьшением урожайности.
|
|
|
В этой связи наиболее перспективным является использование генно-инженерных методов при создании новых улучшенных сортов, что позволяет ввести в геном только сельскохозяйственно полезный признак, без сцепления с ненужными признаками. Так, например, введение дополнительных кодонов лизина в индивидуальные гены проламинов привело бы к синтезу белков, обогащенных лизином, и улучшило бы кормовую и питательную ценность белка. Рассмотрим этапы генно-инженерных манипуляций, приводящих к получению трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка.
Эта работа включает ряд этапов: 1) клонирование генов запасных белков; 2) изучение механизмов тканеспецифичной и временной экспрессии белков и определение последовательно-
204
стей ДНК, определяющих данный механизм; 3) целенаправленное изменение последовательности генов запасных белков с целью улучшения аминокислотного состава; 4) создание векторов, содержащих измененный ген; 5) введение модифицированных генов в растения.
|
|
|
Получение трансгенных растений с улучшенными качествами невозможно без огромного подготовительного этапа, включающего детальное изучение как всего гена, так и его элементов, участвующих в регуляции синтеза белка.
На сегодняшний день охарактеризованы десятки генов запасных белков злаков, бобовых и ряда других растений, изучены структура и свойства этих генов.
Общий план изолирования генов запасных белков включает следующие этапы: 1) получение и частичнуюочистку соответствующей мРНК; 2) синтез и клонирование кДНК; 3) изолирование из геномных библиотек последовательности гена конкретного запасного белка.
В настоящее время клонировано 10 генов гордеинов ячменя, гены а- и Р-глиадинов и глютенина пшеницы, зеинов кукурузы, легумина бобовых, пататина картофеля и ряд других. При этом следует отметить, что для некоторых из генов определена даже нуклеотидная последовательность.
Дальнейшее исследование генов запасных белков показало общность строения этих генов, что представляется логичным, так как они выполняют одинаковую функцию. Так, общим для подавляющего большинства генов запасных белков является отсутствие интронов. Кроме того, у них на расстоянии 300 н. п. от точки начала транскрипции расположена специфическая последовательность в 25 н. п., названная эндосперм-боксом.
|
|
|
Синтез запасных белков имеет жесткую регуляцию: гены экспрессируются только в единственной ткани (проламины злаков только в эндосперме зерна) и в течение короткого периода развития зерна. Чем же это достигается? Для изучения механизма тканеспецифической и временной экспрессии генов используют так называемый делиционный анализ, который предполагает вырезание различных фрагментов гена, с тем чтобы определить значимость того или иного фрагмента для функционирования целого гена. Так, методом делиционного анализа было показано, что именно 25-нуклеотидная последовательность эндосперм-бокса стимулирует экспрессию генов запасных белков в эндосперме зерна. Более того, было показано, что продукт любого гена, перед которым находится последователь-
205
|
|
ность эндосперм-бокса, синтезируется только в семенах или зернах.
Таким образом было определено значение этой 25-нуклеотидной последовательности для синтеза запасных белков, а также необходимость включения ее в состав трансформационных векторов, содержащих модифицированную последовательность генов проламиновых белков с целью их последующего депонирования в семенах или зернах.
|
|
|
Рассмотрим следующий этап в получении трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка на примере модифицированного α-зеина кукурузы. Дополнительные кодоны в последовательность гена вводили с помощью олиго-нуклеотиднаправленного мутагенеза. Впервые такая работа была проведена по введению кодонов лизина в последовательность гена, и как раз на гене α-зеина. Теперь такое введение новых триплетов является довольно обычным.
После модификации нуклеотидной последовательности гена β-зеина следовало соединение всех частей в вектор для трансформации. Это осуществлялось с использованием рестриктаз, вырезающих необходимые фрагменты гена, в нашем случае модифицированного гена α-зеина, из клона геномной библиотеки, и промотора, в данном случае это промотор β-фазолинового гена. Кроме того, в состав конструкции входила последовательность эндосперм-бокса. Соединение этих фрагментов ДНК и клонирование в вектор происходило с использованием ДНК-лигазы.
Кроме того, в состав вектора должен входить ген-маркер, по которому будет вестись селекция. В наиболее часто используемых конструкциях таким маркерным геном является ген KmR, определяющий устойчивость к антибиотику канамицину. Наличие маркерного гена необходимо для того, чтобы на ранних стадиях можно было отобрать только те растения, в геном которых был интегрирован вектор, так как невозможно отличить на стадии каллуса или ранних этапов регенерации трансформированные растения от нетрансформированных. Если трансформацию проводят с помощью агробактерии, то выбираются векторные системы на основе Ті-цдазмиды и интересующий нас ген вместе с геном-маркером встраивается в область Т-ДНК.
Таким образом, в Т-ДНК область вектора входит модифицированная последовательность гена а-зеина с промоторной областью, маркерный ген KmR, определяющий устойчивость к канамицину, и повторы правой и левой границы, фланкирующие Т-ДНК. Векторную конструкцию вводят в клетки агробактерии.
206
Трансформация растительных клеток табака происходит при кокультивировании фрагментов листа табака и агробактерии, в результате чего происходит встраивание векторной конструкции с модифицированным геном зеина в отдельные клетки мезофила листа. Затем фрагменты листьев табака переносятся на среду для регенерации. Введение в состав среды для регенерации растений-трансформантов антибиотика канамици-на приводит к выживанию только тех растений, геном которых содержит векторную последовательность модифицированного гена запасного белка и гена-маркера. Полученные растения-трансформанты, отобранные на селективной среде с антибиотиком, анализируют на присутствие векторной конструкции методом блот-гибридизации и определяют уровень экспрессии модифицированного белка.
Таким образом были получены растения табака, трансформированные геном модифицированного α-зеина кукурузы, обогащенного лизином (рис. 3.21). Модифицированный белок ак-
тивно синтезировался в семенах, трансформированных этим вектором растений кукурузы, с получением линий кукурузы с улучшенным качеством зерна. В дальнейшем такие трансгенные линии могут использоваться при выведении новых сортов методами классической селекции.
Эксперимент по трансформации пшеницы геном высокомолекулярной субъединицы белка глютенина с измененной последовательностью показал, что введение в геном растения модифицированного гена проламина приводит к активному синтезу модифицированного белка и влияет на состав и уровень соответствующих запасных белков, что, в конечном итоге, привело к улучшению хлебопекарного качества пшеничной муки.
Одним из новых подходов к улучшению состава белков является конструирование химерных генов на основе генов запасных белков однодольных и двудольных. В качестве исходных генов были использованы ген гордеина В1 ячменя и легумина В4 бобов. Конструкцией, содержащей такой химерный ген, были протрансформированы растения табака и получены трансгенные линии.
Таким образом становится реальной возможность манипулирования белковым составом эндосперма зерновых методами генетической инженерии.
Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 475; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!