Генетические элементы, регулирующие экспрессию генов.

⇐ ПредыдущаяСтр 10 из 33Следующая ⇒

Многие бактериальные гены устроены таким образом, что они способны функционировать с существенно разной эффективностью. У Е. coli , например, относительное содержание различных белков варьирует в очень широких пределах(от менее чем 0,1% до 2%) в зависимости от их функций; при этом каждый белок в хромосоме Е. coliкодируется единственным геном. Такие вариации обусловлены действием системы контроля генной экспрессии, которая осуществляется главным образом на уровне транскрипции ДНК. Таким образом, чаще всего уровень активности гена связан с количеством синтезируемой на нем мРНК, т. е. с активностью фермента РНК-полимеразы.

Последовательности ДНК, расположенные перед началом структурного гена и определяющие степень активности РНК-полимеразы, называются регуляторными последовательностями (рис. 3.15). Одна из таких последовательностей представляет собой участок ДНК, с которым связывается РНК-по-лимераза. Этот участок называется промотором. Последовательность оснований промотора определяет частоту инициации синтеза мРНК, причем замена одного основания в этой последовательности может привести к уменьшению частоты инициации в 1000 раз.

Регуляция экспрессии у Е. coliпроисходит также и на уровне трансляции. Последовательность оснований длиной 6—8 нуклеотидов, расположенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУГ, определяет эффективность трансляции. Эта последовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой. Как правило, он отстоит на 8 нуклеотидов от инициирующего кодона, и его сдвиг в ту или иную сторону может резко снижать эффективность трансляции соответствующей мРНК. Описанный участок называется последовательностью Шайна — Дальгарно, по имени исследователей, впервые его идентифицировавших.

182

У эукариотических организмов механизм регуляции транскрипции гораздо более сложен. В результате клонирования и секвенирования генов эукариот обнаружены специфические последовательности, принимающие участие в транскрипции и трансляции. Эти последовательности по своей первичной структуре и расположению относительно инициирующего кодона отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК-полимераза их не «узнает». Таким образом, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем прокариотических регуляторных элементов. Это обстоятельство необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии.

Экспрессируемые векторы. Экспрессия генов в бактериях. Для конструирования рекомбинантной ДНК, содержащей в своем составе ген, который должен экспрессироваться, придерживаются следующей стратегии. Синтезируют кДНК или из клонотеки выделяют клетки, несущие фрагмент генома с нужным геном, и клонируют их в соответствующем векторе. Фрагменты геномной ДНК подвергают модификации — удаляют из них некодирующие области и участки соседних генов. Часто для проведения этой операции необходимо секвенирование данного фрагмента ДНК. Затем конструируются промежуточные рекомбинантные ДНК, в которых ген помещается под контроль бактериальных регуляторных элементов (промотор, оператор, точка связывания с рибосомами). Эти регуляторные элементы

183

выделяют специально для этой цели или из гибридных плазмид, сконструированных специально как источники регуляторных элементов. Полученная конструкция встраивается в подходящий вектор, например, pBR322 (рис. 3.16), и ген экспресси-
руется в бактериальной клетке.

Однако удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающиеактивную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена Р-лактамазы (это ген устойчивости к ампициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst 1, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена. В результате трансляции был получен химерный полипептид Р-лактамазаинсулин, из которого после удаления аминокислотной последовательности р-лактамазы удалось получить биологически активный инсулин.

Промотор гена Р-лактамазы нерегулируемый, а использование таких промоторов не всегда удобно. Дело в том, что большое количество белка может блокировать рост бактерий. Кроме того, интенсивная транскрипция рекомбинантной ДНК может помешать репликации плазмиды, и она будет утрачена. Поэтому удобнее использовать регулируемые сильные промоторы, включение которых, а значит, и синтез чужеродного белка можно осуществить, когда получена большая бактериальная масса. К таким промоторам относится термочувствительный промотор pL, который ответствен за экспрессию нескольких генов бактериофага. Белок-peпpeccop, блокирующий действие этого промотора, активен при 31° С, но неактивен при 38° С. Таким образом, при инкубировании бактерий при 31° С чужеродный ген не экспрессируется. При повышении температуры pL-peпpeccop инактивируется и наблюдается высокий уровень

184

синтеза нужного белка. Его количество может достигать 10% суммарного белка, синтезируемого бактериальной клеткой.

Эффективной экспрессии генов в составе плазмиды можно также достичь и за счет некоторых других мощных регулируемых промоторов, например: 1) Trp-промотора триптофанового оперона, который регулируется репрессором и может регулироваться 3-индолилуксусной кислотой или триптофановым голоданием; 2) Lac-промотора лактозного оперона, который также регулируется репрессором и может индуцироваться субстратом (лактозой); 3) гибридного trp-lac(tac)-пpoмотopa, который регулируется lас-репрессором.

Последовательность Шайна — Дальгарно и расстояние от нее до инициирующего кодона существенным образом влияет на эффективность трансляции. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодоном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-концевых аминокислотных остатков происходят от прокариотического гена — источника регуляторных элементов и инициирующего кодона. Гибридные белки часто более стабильны, а химическая или ферментативная обработка позволяет выделить эукариотическую часть белка.

На эффективность продуктивности рекомбинантной ДНК в существенной степени влияет число копий этой ДНК в расчете на клетку. Суммарная активность экспрессируемого гена растет с ростом копийности плазмиды. Таким образом, используя многокопийные плазмиды, можно достичь сверхсинтеза нужных белковых продуктов. Обычно используемые плазмидные векторы (pBR 322 и др.) поддерживаются в клетке в количестве 20—50 копий. Сейчас исследователи имеют в своем распоряжении температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до одной-двух тысяч копий на клетку, не нарушая ее жизненно важных функций. Таким образом можно достичь сверхпродукции плазмидных генов бактериальными штаммами-сверхпродуцентами. Это и представляет собой краеугольный камень биотехнологии, поскольку может давать существенный экономический эффект.

Клонирование и экспрессия генов в бациллах и дрожжах. Успешное проведение генно-инженерных экспериментов на кишечной палочке — естественном обитателе кишечного тракта человека — стало стимулом для проведения аналогичных исследований с различными про- и эукариотическими организмами. Наибольших успехов в технологии рекомбинантных ДНК

185

удалось достигнуть с клетками хорошо изученных организмов Bacillussubtilisи Saccharomycescerevisiae .

В. subtilis— непатогенный почвенный микроорганизм, который растет строго при аэробных условиях. Бациллы не образуют токсинов и не патогенны ни для животных, ни для растений, тогда как клеточная стенка Е. collсодержит эндотоксин — липолисахарид, который довольно трудно отделить от веществ — продуктов генной инженерии. Кроме того, клеточная стенка бацилл имеет простую структуру, и бактерии могут секретировать многие белки в культуральную жидкость. Так, 20 различных видов бацилл синтезируют в общей сложности более 40 ферментов с внеклеточной локализацией. Е. coliпо сравнению с бациллами секретирует в среду относительно мало белков, что существенно затрудняет их выделение и очистку. В бациллах обнаружены плазмиды и фаги, генетика которых хорошо изучена. Клонирование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов. Эти векторы способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев, в данном случае—в В. subtilisи в Е. coli . Векторы были получены комбинацией invitro фрагментов плазмид В. aureus , Е. coliи хромосомных фрагментов бацилл. Существует, однако, проблема экспрессии чужеродной ДНК. Дело в том, что гены Е. coliсо своими регуляторными районами не функционируют в В. subtilis , и для преодоления этого барьера необходимо использовать собственные (гомологичные) регуляторные районы. Таким образом в Е. coliбыли проклонированы гены trp-оперона, преинсулина, антигенов гепатита В, ящура и их белковые продукты синтезировались в В. subtilis . Дрожжи Saccaharomycescerevisiaeпринадлежат к эукариотическим организмам, и организация их генетического аппарата гораздо сложнее, чем у Е. coliи В. subtilis . Этот вид наиболее полно исследован с генетической точки зрения. В гаплоидных клетках содержится 17 хромосом. Однако размер генома невелик, всего в четыре раза больше, чем у Е. coli . В составе хромосом идентифицировано несколько сотен генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно реплицирующуюся кольцевую ДНК длиной два микрона (так называемое 2 мкм-кольцо). Эта дрожжевая плазмида содержит примерно 6300 пар оснований и имеет примерно 50—100 копий на клетку.

Вследствие сравнительно малого размера генома и короткого времени регенерации (несколько часов) экспериментировать с дрожжевыми клетками так же легко, как с большинством прокариот. Однако при этом можно исследовать весьма сложные генетические процессы, характерные для эукариот.

186

Процедура введения ДНК в клетки дрожжей не представляет сложности. Целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами и получают так называемые «сферопласты». Их инкубируют с ДНК в присутствии СаС1₂ и полиэти-ленгликоля. При этом мембрана становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкубация сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку.

Поскольку ряд генов дрожжей способен комплементировать мутации Е. coli , удалось достичь больших успехов в клонировании генов дрожжей. Для этого тотальную ДНК дрожжей после обработки рестриктазой клонируют в плазмиде и затем трансформируют этими плазмидами клетки Е. coli , несущие соответствующие мутации. Среди полученных трансформантов нетрудно отобрать те плазмиды, которые несут ген, комплемен-тирующий мутацию. Затем плазмиды можно использовать для трансформации сферопластов мутантных штаммов дрожжей.

Однако использование челночных векторов позволяет комплементировать мутации в самих дрожжевых клетках. Сконструированные челночные векторы содержат дрожжевой селективный маркер (Leu 3, his 3, ura 3 и т. п.), дрожжевой репликатор, обеспечивающий репликацию плазмиды в дрожжах, и бактериальный репликатор. Наиболее распространенные дрожжевые репликаторы выделены из 2 мкм-плазмиды дрожжей, хромосомной ДНК и митохондриальной ДНК.

Дрожжевую ДНК, расщепленную подходящей рестриктазой, клонируют в челночном векторе и размножают в Е. coli . Сферопласты дрожжей трансформируют смесью полученных плазмид. Плазмиды, комплементирующие мутацию в сферопластах-реципиентах, в селективных условиях можно отобрать, затем выделить и клонировать в Е. coliв больших количествах. Таким путем можно клонировать любой ген, для которого идентифицированы мутации.

С помощью челночного гена удалось ввести гены лейкоцитарного интерферона человека в клетки дрожжей. Уже сконструирован штамм дрожжей, который выделяет в культуральную среду почти чистые α-, β- и γ-интерфероны. Для биологической активности интерферонов, которые представляют собой гликопротеины, существенно наличие углеводных групп. Клетки дрожжей, подобно клеткам млекопитающих, способны синтезировать такие группы и присоединять их к белковым молекулам. Бактериальные клетки таким свойством не обладают. Таким образом экспрессия генов млекопитающих значительно облегчает получение функционально активного продукта.

187

Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 332; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 5 6 7 8 91011 12 13 14 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!