ВОЗНИКНОВЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

 

Таинственные процессы размножения и зарождения новой жизни начали привлекать исследователей еще в XIII в. в пери­од развития естествознания. К этому периоду относятся и пер­вые научные эксперименты по гибридизации растений. Точные количественные исследования, позволяющие сформулировать генетические законы, были выполнены в 1856—1863 гг. чеш­ским исследователем-любителем Грегором Менделем. Он пер­вым сформулировал проблему и точно поставил эксперимент. Удачный выбор объекта (обычный горох) и тщательный анализ минимального количества признаков привели Менделя к от­крытию законов доминирования признаков и независимости комбинации различных признаков.

В своих работах Мендель вводит основную концепцию гене­тики: существует единица наследственности в виде некоторого дискретного фактора, который передается от родителей потом­ству. Иными словами, Мендель показал материальность и дис­кретность носителей наследственных свойств — генов.

В 1875 г. Оскар Гертвиг описал процесс оплодотворения как соединение двух клеток. Август Вейсман, обобщив исследо­вания, касающиеся деления клеток, назвал ядра клеток носите­лями наследственных свойств. В 1873 г. Фридрихом Шнейдером в клеточном ядре были открыты «цветные тельца» — хромосо­мы. Вскоре выяснилось, что у каждого определенного вида рас­тений или животных число хромосом в соматических клетках одинаково, а в половых клетках их в два раза меньше. При оп­лодотворении получается двойной набор хромосом, характер­ный для взрослых индивидуумов. Так эмбриология и цитология заложили надежную основу для исследования носителей на­следственности.

В начале XX в. два цитолога Уолтор Сеттен и Теодор Бове-ри показали, что законы Менделя очень хорошо объясняют рас-

87

пределение хромосом при делении клетки. Было положено на­чало хромосомной теории наследственности.

В первой декаде XX в. в ряде исследований обнаружилось несоответствие полученных результатов с законами Менделя. Так, в 1906 г. Уильям Бетсон и Р. Пеннет, исследуя парные признаки, установили, что их распределение не согласуется с законами Менделя. Значительно позже стало понятно, что ис­следуемые признаки определяются большим числом генов и их анализ методами классической генетики крайне затруднителен.

Обнаруженные противоречия были, в сущности, предшест­вием нового открытия. И его сделал Томас Морган. Он сумел объединить данные статистики и результаты исследования про­цессов, происходящих в клетке. Объектом исследования была выбрана плодовая мушка дрозофила D . melanogaster , которая оказалась идеальным объектом для генетических исследований.

Изучая распределение наследственных признаков, Морган обнаружил, что они делятся на четыре связанные между собой группы. Это соответствует количеству хромосом в клетках дро­зофилы. Он назвал этот феномен сцеплением генов. Установив, что определенный ген всегда присутствует в определенной хро­мосоме, Морган доказал, что гены находятся в хромосомах. Он также показал, что происходит обмен генетическим материа­лом между разными хромосомами. Этот процесс получил на­звание кроссинговера.

Морган показал, что гены выстроены линейно по длине хро­мосомы. Экспериментальные данные привели его к замечатель­ной идее о создании генетических карт. Стало возможным оп­ределять относительное расстояние между генами в хромосоме путем вычисления процента кроссинговера.

В опытах Моргана частота наблюдаемых мутаций была крайне низка. С развитием концепции гена стало ясно, что в основе мутации лежат химические изменения в веществе — но­сителе наследственной информации. К исследованию причин возникновения мутаций и возможностей их получения искусст­венным путем приступил ученик Моргана Г. Дж. Меллер. Он начал с облучения мушек светом и, наконец, в 1926 г. дошел до рентгеновских лучей. За год до этого Г.А. Надсон совместно с Г.С. Филипповым в СССР провели подобные опыты, подвергая дрожжи рентгеновскому излучению.

Эти эксперименты положили начало радиобиологии. Меллер добился почти 100%-ного уровня мутаций в потомстве дрозофил, что в тысячи раз превышает частоту мутаций в естественных ус­ловиях. Метод получения искусственных мутаций быстро нашел применение в селекционной практике. Уже в 1928 г. Л. Стедлер

88

успешно применил его к кукурузе. В 30-е годы биолог Н.В. Ти­мофеев-Ресовский и физик-теоретик Макс Дельбрук создали теорию мишени, объясняющую действие радиации.

Хромосомная теория наследственности явилась высшим дос­тижением классической генетики. Хромосомные карты и воз­можность создания искусственных мутаций с помощью радиа­ции или химических мутагенов оказались исключительно эф­фективными для селекционной работы. Чисто интуитивный искусственный отбор, осуществляемый в течение тысячелетий, превратился в точную науку, и это позволило существенно ус­корить создание новых сортов.

Рождение молекулярной биологии. Методами формальной генетики было установлено, что ген — это дискретный фактор наследственности, часть хромосомы, и что он переходит от ро­дителя к потомку. Однако, несмотря на большие достижения классической генетики, основная концепция этой науки — кон­цепция гена — оставалась без материального содержания. Ар­сенал генетических методов не давал возможности выяснить хи­мическую природу гена и объяснить, как гены управляют фи­зиологическими процессами в клетке, как они осуществляют собственное удвоение в течение цикла клеточного деления.

Классическая генетика принципиально отличается от воз­никшей на ее основе молекулярной генетики. Основной едини­цей классической генетики является неделимый и абстрактный ген. Основная единица молекулярной генетики — конкретная химическая молекула — мономер, из сотен и тысяч которых со­стоит ген, т. е. ген играет роль вторичного агрегата элементар­ных единиц.

Исследование детальной физической и химической природы гена, молекулярных механизмов хранения и передачи информа­ции — главная задача молекулярной генетики.

Молекулярная генетика — составная часть молекулярной биологии, науки, возникшей в середине XX в. Эта наука обяза­на своим развитием в значительной степени физикам и хими­кам, которые ставили своей задачей изучение структуры биоло­гически важных макромолекул и познание молекулярных меха­низмов биологических процессов.

На протяжении многих лет самым главным классом макро­молекул считали белки. Многие в то время предполагали, что и гены имеют белковую природу. Их сложная структура не под­давалась расшифровке теми методами, которыми в то время располагала химия. Кроме того, думали, что несмотря на то, что ген подчиняется тем законам физики, которые уже извест­ны, изучение его свойств может привести к открытию новых за-

 

89

конов физики, присущим только живым системам. Известный ученый Г. Стент пишет об этом периоде так: «Многие физики, вдохновленные романтическим стремлением открыть другие за­коны физики через изучение генетики, оставили ту работу, к которой они были подготовлены, и обратились к проблеме при­роды гена. Вторжение этих людей в генетику и родственные ей области биологии в 40-х годах произвело в этой науке револю­цию, которая, когда пыль рассеялась, оставила в качестве сво­его наследия молекулярную биологию. В результате этой рево­люции, в частности, из классической генетики развилась моле­кулярная генетика и к 1965 г., к столетию работы Менделя, природа гена была уже выяснена».

К исследованию структуры биологически важных микромо­лекул подошли с двух сторон. Одна из школ стремилась приме­нить физические методы, в особенности рентгеноструктурный анализ, для определения трехмерной структуры макромолекул. В 1934 г. было показано, что дифракция рентгеновских лучей на монокристаллах белка позволяет проводить исследование их структуры с разрешением, близким к атомному. Впоследствии этот подход был применен к изучению структуры нуклеиновых кислот. Другая школа, возглавляемая Дельбрюком и Луриа, сосредоточила свои усилия на выяснении молекулярных меха­низмов генетических процессов, опираясь, в основном, на изуче­ние вирусов бактерий (бактериофагов).

В 1943 г. Освальд Эйвери с сотр. показали, что носителем генетической информации является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). С этого времени многие исследователи сосредо­точили свои усилия на изучении нуклеиновых кислот. И всего через 10 лет, в 1953 г., была создана модель ДНК (двойная спираль). Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии, поскольку открытие структуры ДНК объясняет, каким образом генетическая информация может быть записана в молекулах ДНК, и в то же время позволяет высказать предположение о химическом механизме самовос­произведения этих молекул. В открытии ДНК наиболее ярко проявилась методология молекулярной биологии — исследова­ние структуры макромолекул и ее связи с функцией.

ИССЛЕДОВАНИЕ ДНК

 

Ко времени открытия структуры ДНК история изучения нуклеиновых кислот насчитывала уже около восьмидесяти лет. Честь их открытия принадлежит швейцарскому биохимику

 

90

Фридриху Мишеру, который в 1868—1872 гг. выделил из ядер клеток гноя и спермы лосося новое фосфорсодержащее вещест­во, названное им нуклеином (от греч.— ядро). Примерно в те же годы Мендель старался убедить ученый мир в значении своей работы. До середины XX столетия никто не предполагал, что эти два открытия столь тесно связаны между собой. Работа Менделя пребывала в забвении до 1901 г., а результаты иссле­дований Мишера в подробном изложении были опубликованы после его смерти — в 1890 г. Незадолго до этого, в 1889 г., не­мецкий химик Р. Альтман впервые получил свободный от бел­ков нуклеин Мишера и предложил назвать его нуклеиновой ки­слотой.

К этому времени А. Коссель выделил основные составные части нуклеина: содержащие азот вещества — аденин и гуанин, фосфорную кислоту и соединения из группы углеводов. Впо­следствии удалось установить, что в природе существует два типа нуклеиновых кислот ДНК и РНК (у последней са­хар— дезоксирибоза — заменен на рибозу, а одно из четырех азотистых оснований — тимин — на урацил). Так как ДНК вы­деляли в основном из тимуса теленка, а РНК — из дрожжей и растений, то долгое время бытовало представление о том, что ядра клеток животных содержат только ДНК, а ядра клеток растений — только РНК- Только к середине 30-х годов было до­казано, что ДНК и РНК содержатся в каждой живой клетке. С развитием методов цитохимии и гистохимии, а также методов фракционирования субклеточных структур к концу 40-х годов было установлено, что ДНК локализуется преимущественно в ядре, а РНК в цитоплазме клеток.

К началу 50-х годов были установлены основные принципы химического строения нуклеиновых кислот. Была выяснена структура их мономеров — нуклеозидов и нуклеотидов, и дока­зано, что и в ДНК, и в РНК нуклеотидные остатки связаны только 3' — 5'-фосфодиэфирной связью.

Гены состоят из ДНК. До 40-х годов исследование нуклеи­новых кислот считалось весьма скучным и вообще бесперспек­тивным занятием. Так продолжалось до 1944 г., когда Эйвери, Мак-Леод и Мак-Карти установили, что дезоксирибонуклеино­вая кислота является носителем генетической информации. Это выдающееся открытие, приведшее к установлению химической природы генов. Его история ведет свое начало с 1928 г., когда Фред Гриффит провел эксперименты с заражением мышей пневмококками. Пневмококки вызывают пневмонию у человека и других чувствительных к ним млекопитающих. Они обычно окружены слизистой блестящей оболочкой — полисахаридной

 

91

капсулой. Этот наружный слой имеет существенное значение для проявления патогенности бактерий. Мутанты, лишенные полисахаридной оболочки, не патогенны. Патогенные бактерии дикого типа обозначают буквой S (от англ. smooth — гладкий), так как они образуют гладкие колонии, а мутантные бактерии, не имеющие капсулы, — буквой R (от англ. rougth — шерохова­тый), так как они образуют шероховатые колонии.

Гриффит обнаружил, что непатогенный мутант можно трансформировать в патогенную S-форму следующим образом. Он инъецировал мышам смесь живых бактерий R-формы и убитых нагреванием пневмококков S. При этом были получены поразительные результаты. Оказалось, что указанная смесь вызывала гибель мышей, хотя ни живые пневмококки, ни уби­тые нагреванием пневмококки, инъецированные порознь, смер­ти мышей не вызывали. В крови погибших мышей содержались живые S пневмококки. Следовательно, убитые нагреванием пневмококки каким-то образом трансформировали живые R- и живые S-пневмококки. Это изменение стабильно наследовалось: трансформированные пневмококки давали патогенное потомст­во S-формы.

Впоследствии R+S-трансформацию удалось воспроизвести в бесклеточной системе (invitro). Некоторые R-клетки в расту­щей культуре трансформировались в S-форму при добавлении бесклеточного экстракта убитых нагреванием пневмококков. Это открытие позволило установить химическую природу трансформирующего фактора.

Эйвери с сотр. в своих классических исследованиях показа­ли, что трансформирующий фактор — это дезоксирибонуклеи-новая кислота. Новое доказательство трансформирующей ак­тивности ДНК было получено несколько позже, когда удалось очистить фермент дезоксирибонуклеазу, разрушающую ДНК. Было показано, что добавление этого фермента необратимо инактивирует трансформирующий фактор.

Публикация выводов Эйвери с сотр. в 1944 г. была встрече­на с большим удивлением и недоверием, так как едва ли кто-либо ранее придавал ДНК информационную роль. Вездесу­щему присутствию ДНК в хромосомах большей частью припи­сывали чисто физиологическую или структурную роль. В то же время считали, что именно хромосомный белок придает генам информационную роль, поскольку еще в начале XX в. были вы­явлены различия в специфичности белков у различных организ­мов. Авторы понимали трудность обоснования генетической ро­ли ДНК и в заключительной части своей работы высказали следующее утверждение: «Если результаты представленного

 

92

исследования о природе трансформирующего начала подтвер­дятся, то придется признать, что нуклеиновые кислоты облада­ют биологической специфичностью, химическая основа которой еще не установлена».

В 1952 г. Альфред Херши и Марта Чейз доказали генетиче­скую роль ДНК в совершенно иной системе — при изучении ви­руса (бактериофага), заражающего бактерию Е. coli . Когда фа­ги добавляют к бактериальной культуре, они адсорбируются на наружной поверхности бактерии и вводят в нее определенное вещество, в результате чего примерно через 30 мин бактерия разрывается (лизирует), высвобождая большое число новых фа­говых частиц — потомков, адсорбированных фагов.

Эксперимент был поставлен следующим образом. Бактерии инфицировали фагом Т2, у которого радиоактивным изотопом метили либо ДНК-компоненты (изотопом фосфора — ³²Р), либо белковые компоненты (изотопом серы — ³⁵S). Фаги смешивали с бактериями и неадсорбированные частицы удаляли центри­фугированием. Затем инфицированные бактерии энергично встряхивали и разделяли полученный препарат на две фрак­ции путем центрифугирования. Одна фракция содержала пус­тые фаговые оболочки, отделившиеся от клеточной стенки бак­терий, другая —сами бактерии. Анализ фракций показал, что S метка была связана с оболочками фага. Большая же часть метки ³²Р оказалась внутри инфицированных бактерий. В по­томстве фага после инфицирования было найдено примерно 30% исходной метки ³²Р. А от исходного белка в фаговом по­томстве обнаружили лишь менее 1%. Этот эксперимент прямо показывает, что родительская фаговая ДНК проникает в бакте­рию и затем становится частью фагового потомства. Именно так должно происходить наследование генетического материала.

Эксперименты Херши и Чейз убедительно подтвердили фак­ты, открытые восемью годами раньше Эйвери с сотр. на другой системе, и результаты работы были сразу восприняты как до­казательство генетической роли ДНК.

Компоненты и первичная структура ДНК. Нуклеиновые ки­слоты состоят из последовательности химически связанных меж­ду собой нуклеотидов, т. е. они представляют собой полинуклео-тиды. Каждый нуклеотид содержит гетероциклическое кольцо из атомов углерода и азота (азотистое основание), пятиуглеродное сахарное кольцо (пентозу) и фосфатную группу.

Между азотсодержащими кольцами, встречающимися в нуклеотидах, имеется родственная связь. Цитозин (Ц), тимин (Т) и урацил (У) называют пиримидиновыми основаниями, так как они представляют собой простые производные шестичлен-

 

93

 

ного пиримидинового кольца; гуанин (Г) и аденин (А) — пуриновые основания, второе пятичленное кольцо которых сконден­сировано с шестичленным циклом (рис. 2.1).

Сахар, входящий в состав нуклеотида,— это пентоза, кото­рая может присутствовать в одной из двух форм: β-D-рибоза и (β-D-2-дезоксирибоза. Различие между ними состоит в том, что гидроксильная группа рибозы при 2'-углеродном атоме пентозы замещена в дезоксирибозе на атом водорода. Нуклеотиды, со­держащие рибозу, называются рибонуклеотидами и являются мономерными звеньями РНК, а нуклеотиды, содержащие дезоксирибозу, являются дезоксирибонуклеотидами, и из них строится ДНК.

Нуклеозид— это нуклеотид бесфосфатной группы (групп). Он образуется соединением одного из азотистых оснований с

94

пентозным кольцом посредством гликозидной связи между С'₁—N-атомом пентозного кольца и NЗ-атомом пиримидина или N9 пурина. Чтобы избежать путаницы в нумерации атомов азотистых оснований и Сахаров, положение атомов углерода пентозы пишут со штрихом.

Одна, две или три фосфатные группы могут быть присоеди­нены эфирной связью к 5'-углероду пентозы. Образующиеся при этом нуклеотиды соответственно называют нуклеозид-5'-моно-, нуклеозид-5'-ди- и нуклеозид-5'-трифосфатами и обозначают соответственно ХМФ, ХДФ и ХТФ, где X — то или иное азотистое основание. При физиологических значениях рН (близких к 7) основания не заряжены. Однако одна, две или три фосфатные группы, входящие в состав нуклеотида, являют­ся кислыми и несут два, три или четыре отрицательных заряда

соответственно.

Нуклеотиды могут выступать в качестве переносчиков энер­гии. При этом трифосфатный эфир аденина (АТФ) гораздо ча­ще, чем другие нуклеотиды, участвует в переносе энергии меж­ду сотнями индивидуальных внутриклеточных реакций.

РНК и ДНК построены, соответственно, из связанных кова-лентно рибонуклеотидных или дезоксирибонуклеотидных звень­ев, образующих полинуклеотидные цепи. Звенья соединяются между собой с помощью фосфоднэфирных мостиков, связываю­щих 5'-гидроксильную группу одного нуклеотида и З'-гидроксильную группу следующего. При этом образуется регулярная основная цепь (сахарофосфатный остов) фосфат — са­хар— фосфат — сахар — и т. д. Азотистые основания присое­динены к сахарам аналогично тому, как присоединены боковые группы в белках; они как бы «торчат» из сахарофосфатного ос­това.

Концевой нуклеотид на одном конце цепи имеет свободную 5'-группу, на другом конце З'-группу. Таким образом полинуклеотидная цепь обладает полярностью, и, согласно принятому соглашению, последовательность оснований читается в направ­лении от 5'- к З'-углеродному атому пентозы. О первом и по­следнем нуклеотидах говорят, что они находятся на 5'- и З'-концах цепи соответственно.

До 1950 г. доминировала тетрануклеотидная теория струк­туры ДНК, рассматривающая полинуклеотид как монотонную макромолекулу, состоящую из многократно повторяющихся наборов четырех нуклеотидов. Такая молекула, очевидно, не способна выполнять роль носителя генетической информации. В 1948 г. Хочкисс и Эрвин Чаргафф применили тогда еще но­вый метод хроматографии на бумаге для разделения и количе-

95

ственной оценки компонентов нуклеиновой кислоты. Этот ме­тод давал возможность проводить более точный анализ нуклеотидных оснований, высвобождающихся при полном гидролизе ДНК. Анализы показали, что в противоположность требованиям тетрануклеотидной теории четыре азотистых ос­нования не обязательно присутствуют в ДНК в точно равных соотношениях. Чаргафф проанализировал образцы ДНК, вы­деленной из разных организмов, и показал, что молярные со­отношения оснований в молекуле ДНК могут варьировать в широких пределах в зависимости от ее биологического источ­ника. Но если она не монотонна, то тогда вполне возможно, что именно состав ее оснований и обусловливает ее биологиче­скую специфичность.

К 1952 г. удалось сформулировать теорию, объясняющую, каким образом ДНК может осуществлять перенос генетической информации в опытах с трансформацией. Основное положение этой теории сводилось к следующему: если молекула ДНК со­держит генетическую информацию, то последняя определяется не чем иным, как специфической нуклеотидной последовательно­стью четырех нуклеотидных оснований в полинуклеотидной цепи. ДНК — двойная спираль. В 1953 г. Джеймс Уотсон и Френ­сис Крик установили трехмерную (вторичную) структуру ДНК и сразу же предложили механизм ее репликации (удвоения). Это блестящее достижение стоит в ряду важнейших событий в истории биологии, так как оно открыло путь к пониманию функции гена на молекулярном уровне. Не случайно 1953 год считают годом рождения молекулярной биологии.

Две группы фактов легли в основу модели ДНК- Первая связана с  успешным использованием рентгеноструктурного анализа для изучения биологических макромолекул. Одним из первых исследователей, высказавших соображения о трехмер­ной структуре ДНК, был Астбюри (именно он ввел в 1940 г. термин «молекулярная биология»), который предположил, что полимер ДНК представляет собой стопку уложенных один над другим нуклеотидов. Его измерения показали также, что нук-леотидные остатки, ориентированные перпендикулярно длинной оси молекулы, располагаются вдоль оси через каждые 3,4 Ᾰ (1 ангстрем = 10^-10 м). Группа исследователей, продолжившая рентгеноструктурные исследования ДНК, начатые Астбюри, и работавшая под руководством Уилкинса, достигла важного ме­тодического решения: им удалось приготовить высокоориенти­рованные нити ДНК, на основе которых получили рентгено­грамму, показывающую множество ранее не проявлявшихся деталей.

 

96

 

 

Уотсон и Крик к тому времени рассмотрели несколько воз­можных вариантов структуры ДНК, однако из-за плохого каче­ства рентгенограмм им не удалось прийти к каким-либо опре­деленным выводам. Рентгенограмма, полученная Розалиной Франклин, сотрудницей Уилкинса, помогла узнать недостаю­щие детали, и в течение нескольких недель вопрос о структуреДНК был решен.

Определяющую роль в установлении структуры ДНК сыг­рали факты, полученные Чаргаффом при анализе нуклеотидного состава ДНК различных организмов. В его докладе, сделан­ном в 1950 г., можно найти следующее утверждение: «Получен­ные результаты служат опровержением   тетрануклеотидной гипотезы. Следует, однако, отметить — хотя трудно еще ска­зать, не является ли это чистой случайностью,— что во всех изученных до сих пор дезоксирибонуклеиновых кислотах моляр­ные отношения пуринов к пиримидинам в целом, а также аде-нина к тимину и гуанина к цитозину близки к 1". В этом утвер­ждении впервые была сформулирована важная структурная особенность ДНК, подтвержденная последующими анализами: несмотря на довольно широкое разнообразие в составе (у бак­терий молярная доза Г + Ц варьирует от 26 до 74%), проявляе­мое различными типами ДНК, молярное содержание тимина равно молярному содержанию аденина, так же как содержание гуанина равно содержанию цитозина.

В апреле 1953 г. Уотсон и Крик опубликовали небольшую статью, в которой постулировали структуры ДНК (рис. 2.2). В том же выпуске Уилкинс с сотр. опубликовали данные рентге­ноструктурного анализа, подтверждающие правильность пред­ложенной модели. Характерные особенности этой модели сво­дятся к следующему.

1.      Две спиральные полинуклеотидные цепи имеют форму правильной правой спирали и закручены вокруг общей оси. Цепи имеют противоположную ориентацию (5'→3' и 3'→5' со­ответственно), т. е. антипараллельны. Следовательно, если по­вернуть спираль на 180°, то ее внешний вид не изменится.

2. Пуриновые и пиримидиновые основания расположены внутри спирали, а остатки фосфата и дезоксирибозы (сахаро-фосфатный остов) — снаружи. Плоскости оснований перпенди­кулярны оси спирали. Плоскости остатков сахара расположены почти под прямым углом к основаниям.

3. Диаметр спирали — 20 А. Расстояние между соседними ос­нованиями вдоль спирали 3,4 А, они повернуты друг относительно друга на 36°. Таким образом, на один виток спирали каждой из цепей приходится 10 нуклеотидов, что соответствует 34 А.

97

 

4. Две цепи удерживаются при помощи водородных связей между парами оснований. Аденин всегда спаривается с тимином, а гуанин с цитозином. Спаривание происходит таким и только таким образом; два пурина занимали бы слишком мно­го места, а два пиримидина, наоборот,— слишком мало, так что регулярная спираль образоваться бы не могла.

5. На последовательность оснований в полинуклеотидной це­пи не накладывается никаких ограничений. Определенная по­следовательность оснований несет конкретную генетическую информацию.

Важнейшее свойство двойной спирали — специфичность связывания оснований. Только при указанном порядке взаимо­действия могут образоваться водородные связи и в то же самое время сохранится постоянный диаметр двойной спирали. Обя­зательное спаривание комплементарных нуклеотидов, с одной стороны, дает объяснение ранее загадочному правилу эквива­лентности Чаргаффа, а с другой стороны, получает неожидан­ное подтверждение от него.

Однако основное значение открытия правил спаривания ос­нований для последующего развития молекулярной генетики лежит не в объяснении этих любопытных данных, а в призна­нии того, что полная молекула ДНҚ является самокомплемен­тарной: если наследственная информация записана в полинук­леотидной цепи в виде специфической последовательности че­тырех оснований, то каждая молекула ДНК несет два полных набора такой информации, хотя и написанной комплементар­ными буквами. Комментируя этот факт, авторы двойной спира­ли замечают: «От нашего внимания не ускользнул тот факт, что специфическое спаривание, которое мы постулировали, по­зволяет предполагать возможный копирующий механизм для генетического материала». Таким образом, информация, необ­ходимая для воспроизведения ДНК, заложена в ее структуре.

Полиморфизм ДНК. Двуспиральную модель молекулы ДНК, предложенную Уотсоном и Криком, считают одним из несомненных фактов молекулярной биологии. Но в последнее десятилетие стало очевидным, что некоторые параметры клас­сической В-формы нужно пересмотреть и даже что ДНК может образовывать другие типы двуспиральных структур. Таким об­разом, под полиморфизмом ДНК подразумевают способность двойной спирали принимать различные конформации.

Рис. 2.2. Комплементарное взаимодействие азотистых оснований (а). Расстоя­ние между Сl'-атомами дезоксирибозы в двух цепях одинаковы для AT- и CG-пар и равны 1,085 нм. Схематическое изображение двойной спирали ДНК (б)

99

 

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК

 

К одному из основных свойств генетического материала от­носится его способность передаваться из поколения в поколе­ние. Для этого каждая клетка должна дублицировать (удваи­вать) свою ДНК перед очередным делением. В результате до­черние клетки получают такую же генетическую информацию, как и у родительских клеток. Процесс самовоспроизведения ге­нетического материала и называется репликацией. Репликация лежит в основе размножения и развития живых организмов.

Репликация ДНК полуконсервативна. Механизм репликации был предложен Дж. Уотсоном и Ф. Криком — авторами теории двойной спирали ДНК. Он предполагает расплетение двух цепей ДНК с тем, чтобы каждая из них могла служить матрицей для сборки второй цепи в соответствии с принципом комплементарности. Таким образом, на матричной, или родительской, цепи оди­ночные нуклеотиды выстраиваются в определенном порядке и их последующая полимеризация приводит к образованию новой, или дочерней, цепи, комплементарной первой (рис. 2.3).

Несколькими годами позднее был открыт фермент, осущест­вляющий процесс полимеризации нуклеотидов. Его назвали ДНК-полимеразой. В качестве субстратов он использует дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и катализирует их полимериза­цию на матрице (одноцепочечной ДНК). Источником энергии служит гидролиз пирофосфата.

Предложенный механизм репликации был назван полукон­сервативным, поскольку каждая из идентичных друг другу до­черних молекул состоит из одной старой и одной новой цепи ДНК. Первые доказательства полуконсервативной репликации были получены в экспериментах М. Мезельсона и Ф. Сталя. Они использовали метод равновесного ценрифугирования в градиен­те плотности. Суть его состоит в следующем. Концентрирован­ные растворы солей тяжелых металлов, например хлорид цезия, по своей плотности могут соответствовать плотности ДНК- Если ДНК в таком растворе подвергнуть длительному центрифугиро­ванию, то в пробирке сформируется градиент концентрации, а значит, и градиент плотности соли. ДНК при этом займет в про­бирке вполне определенное положение, соответствующее своей плотности. В том случае, когда ДНК представлена смесью моле­кул разной плотности, центрифугирование приведет к разделе­нию препарата на несколько фракций.

В экспериментах было использовано то обстоятельство, что ДНК, содержащая азот ¹⁴N, отличается по плотности от ДНК, содержащей изотоп ¹⁵N, и соответствующие молекулы разделя-

100

 

ются при центрифугировании в градиенте плотности. Клетки.£. coliв течение многих поколений культивировали на среде с N. В результате практически вся бактериальная ДНК содержала в своем составе ^l5N. Затем клетки переносили на среду с N и периодически брали пробы для определения плотности ДНК (рис. 2.4). Оказалось, что после первого деления на среде с ¹⁴ N плотность ДНК была промежуточной между (¹⁵N)ДНК и ( N) ДНК, а после второго деления ДНК разделилась на две фрак­ции: одна с промежуточной плотностью, как после первого де­ления, а другая —с плотностью (¹⁴N) ДНК, причем фракции были равными. После третьего деления3/4^, ДНК имела плот­ность (¹⁴N) ДНК и ^1/₄ — плотность (¹⁴N — ¹⁵N) ДНК- Соотноше­ние и плотность фракций ДНК после каждого деления были в точности такими, как предсказывает модель полуконсерватив­ной репликации.

Модель также предсказывает, что в ДНК с промежуточной . плотностью одна цепь тяжелая, а другая — легкая. С целью подтвердить это предположение фракция с промежуточной плотностью была выделена и денатурирована нагреванием. По-

 

101

 

следующее центрифугирование показало, что эта ДНК дейст­вительно состоит из цепей с различной плотностью.

Опыты, таким образом, полностью подтвердили правильность модели полуконсервативной репликации и стали первым весомым аргументом в пользу двойной спирали Уотсона — Крика.

Новая цепь ДНК синтезируется в направлении 3' →5'. Как уже отмечалось, для репликации необходимо локальное распле-тение двойной спирали в той области, где ДНК в данный мо­мент служит матрицей для синтеза дочерних нитей ДНК. Эта расплетенная часть молекулы называется репликативной вил­кой. Ее можно наблюдать, если во время репликации на корот­кое время добавить радиоактивные («меченые») предшествен­ники ДНК и экспонировать молекулы ДНК на рентгеновской пленке. Такое мечение ДНК называется импульсным. Таким

 

102

 

образом, репликация сопровождается перемещением реплика­тивной вилки вдоль молекулы ДНК и синтезом новых цепей на каждой из старых. Но цепи ДНК антипараллельны, и логично предположить, что одна из дочерних цепей растет в направле­нии 5'→3' а другая — в противоположном, 3'→5'.

Поскольку молекула ДНК несимметрична, для репликации в двух направлениях нужно два различных фермента реплика­ции— две ДНК-полимеразы. Одна из них наращивает цепь ДНК в направлении 5'→3', и тогда каждый очередной мономер (дезоксирибонуклеозидтрифосфат) обеспечивает сам себя энер­гией для присоединения к растущей цепи (носителем энергии является трифосфатная группа). Такой рост на полимерной це­пи называется «ростом с хвоста». Другая полимераза наращи­вает цепь «с головы», т. е. присоединяет новый мономер к бога­тому энергией 5'-концу растущей цепи. Этот мономер, в свою очередь, использует свой трифосфат для присоединения сле­дующего нуклеозидтрифосфата.

Однако у прокариот и у эукариот обнаружены, выделены и охарактеризованы (см. ниже) только 5'→3' ДНК-полимеразы. Возникает проблема синтеза другой цепи ДНК. Для ее решения существенную роль сыграли эксперименты по импульсному включению метки во время синтеза ДНК. Если метка дается на очень короткие промежутки времени, она включается в ДНК, синтезированную в последний момент. Мечеными оказываются те области новых цепей, которые расположены сразу за репликатив­ной вилкой. Исследования размеров меченой ДНК показали, что при репликации бактериальной ДНК сначала на некоторое вре­мя образуются фрагменты длиной 1000—2000 нуклеотидов. Эти фрагменты назвали по имени их первооткрывателя — фрагменты Оказаки. При репликации эукариотической ДНК длина фрагмен­тов Оказаки составляет 100—200 нуклеотидов. Было также пока­зано, что синтез фрагментов идет в направлении от 5' к З'-концу, и впоследствии они соединяются в длинные цепи ДНК. Так воз­никло представление, согласно которому синтез ДНК на обеих матрицах идет в направлении 5'→3' (от хвоста к голове). Но на одной из цепей новая ДНК синтезируется непрерывно, а на дру­гой— фрагментами, стыкующимися в единую полимерную моле­кулу. Первая из цепей называется лидирующей, другая — от­стающей (рис. 2.5). Таким образом, на отстающей нити синтез идет в направлении 5'→3', а сама цепь растет в направлении 3'→5'. Это напоминает шитье «иголкой назад».

ДНК-полимераза — основной фермент репликации. Основ­ные принципы и механизмы репликации сходны у прокариот и

 

103

 

у эукариот. Лучше всего изучена репликация у Е. coli . Основ­ным ферментом репликации у Е. coliявляется ДНК-полимера-за III. Это сложный комплекс белковых молекул, состоящий из семи субъединиц с общей молекулярной массой около 700 кило-дальтон (кД). Некоторые из субъединиц сами по себе обладают полимеразной активностью, но репликацию в клетке (invivo) осуществляет весь фермент, или холофермент. Перед связыва­нием с матрицей холофермент образует комплекс с АТФ, и по­следний гидролизуется в процессе связывания. Фермент связы­вается с ДНК практически необратимо, т. е. остается на мат­рице до окончания репликации. Скорость синтеза ДНК составляет около 1000 нуклеотидов в секунду (!).

В клетках эукариот обнаружены четыре ДНК-полимеразы. Аналогом ДНК-полимеразы III считают эукариотическую ДНК-полимеразу а (альфа). Во время S-фазы клеточного синте­за его количество существенно увеличивается, и он в основном ведет синтез ядерной ДНК. Молекулярная масса фермен­та — 500 кД. Скорость репликации примерно в 10 раз ниже, чем в прокариотических клетках (около 100 нуклеотидов в секунду).

Самокоррекция ДНК-полимеразы. Механизм репликации должен обеспечивать безошибочное копирование матрицы. Включение в новую' цепь ДНК некомплементарных нуклеоти­дов влечет за собой возникновение мутаций, которые могут привести к генетическим изменениям, нарушающим структуру и функции генетического материала. Последствия таких мута­ций сказываются негативно, а иногда пагубно для жизни клет­ки и всего организма.

104

Между тем в нормальной ДНК довольно часто (с частотой 10^-5—10^-6) на короткое время возникают редкие таутомерные формы каждого из оснований. Такие измененные нуклеотиды при репликации могут спариваться с некомплементарными ос­нованиями. Например, с цитозином может образовать пару аденин, а не гуанин. После возвращения нуклеотида в нор­мальное состояние водородные связи распадаются и нуклеоти­ды оказываются неспаренными.

Для избежания ошибочного спаривания ДНК-полимеразы обладают способностью к самокоррекции. Корректирующий механизм заключается в том, что перед присоединением каждо­го последующего нуклеотида к растущей цепи ДНК фермент «проверяет» правильность спаривания предыдущего нуклеоти­да. Если нуклеотиды спарены правильно (т. е. в соответствии с принципом комплементарности), полимераза присоединяет сле­дующий нуклеотид, который впоследствии также будет прове­рен. Если же произошла ошибка спаривания, «неправильный» нуклеотид отщепляется от цепи ДНК. Затем проверяется нук­леотид, предшествующий вырезанному, и так далее. Вырезание нуклеотидов происходит из-за того, что ДНК-полимераза обла­дает кроме полимеразной еще и 3'→5'-экзонуклеазной активно­стью. Когда полимераза, отщепив неспаренный нуклеотид или несколько нуклеотидов, дойдет до нормально спаренных нук­леотидов, восстанавливается ее полимеразная активность, и синтез ДНК продолжается до обнаружения очередной дефект­ной пары.

Используя систему самокоррекции, ДНК-полимераза ведет синтез с исключительно высокой быстротой и точностью. В среднем одна ошибка приходится на 10⁹ нуклеотидов. Геном Е. coliимеет размер 4,2 х 10⁶ нуклеотидов. Это значит, что при ре­пликации 200 геномов допускается всего одна ошибка.

Присутствие у фермента корректирующей способности оз­начает, что для инициации репликации на матрице ему необхо­дим хотя бы короткий участок двуцепочечной ДНК, с которого начинается синтез комплементарной цепи. Такой участок назы­вается праймером, или затравкой. Можно говорить, что всякий самокорректирующий фермент для начала работы нуждается в затравке. Справедливо и обратное утверждение: всякий фер­мент, требующий для работы затравки, обладает способностью к самокоррекции.

Структура репликативной вилки. Репликативная вилка асимметрична. Для синтеза лидирующей цепи, который идет непрерывно, затравка нужна только в начале полимеразной ре-

 

105

акции. Полимераза, ведущая синтез запаздывающей цепи, ну­ждается в затравке перед синтезом каждого фермента. Суще­ствует специальный фермент, создающий затравки. Он называ­ется РНК-праймаза и синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов короткие РНК-праймеры длиной около 10 нуклеотидов. Из вышесказанного ясно, что этот фермент не нуждается в затрав­ке, а значит, он не способен к самокоррекции. Такой фермент делает ошибки примерно в 1000 раз чаще, чем самокорректи­рующий. Ясно, что после синтеза фрагментов Оказаки праймер нужно удалять. В противном случае до 10% (у эукариот длина фрагментов Оказаки 100—200 н. п.) ДНК будет содержать ог­ромное, по сравнению с нормой, число ошибок.

Для удаления праймеров и застраивания образовавшихся брешей в действие вступает особая система репарации ДНК. Основную роль здесь играет ДНК-полимераза IЕ. coliи ана­логичные ферменты других организмов. У эукариот это, по-ви­димому, ДНК-полимераза р. ДНК-полимераза I—это первый из открытых ферментов, катализирующих полимеризацию нук­леотидов. Сначала его считали основным ферментом реплика­ции, а позднее установили его репарирующую роль. ДНК-полимеразу I можно представить как два фермента на одной поли­пептидной цепи. Первый называется фрагментом Кленова и обладает полимеразной и корректирующей (3'→5'-экзонуклеазной) активностями. Другой фрагмент способен отщеплять нук-леотиды в направлении 5'→3', т. е. в направлении синтеза ДНК- Эта 5'→3'-экзонуклеазная активность и дает возмож­ность удалять затравку.

Синтез ДНК на запаздывающей цепи состоит, таким обра­зом, из следующих этапов.

1. РНК-праймаза синтезирует затравки на некотором (рав­ном длине фрагментов Оказаки) расстоянии друг от друга;

2. ДНК-полимераза IIIсинтезирует фрагменты ДНК, начи­ная с З'-конца затравки и заканчивая на 5'-конце предыдущей затравки;

3. ДНК-полимераза I продолжает синтез фрагментов ДНК в направлении 5'→3', одновременно удаляя затравку в том же направлении;

4. Фрагменты ДНК «сшиваются», т. е. образуется фосфодиэфирная связь между началом предыдущего и концом после­дующего фрагментов.

Целесообразен ли такой сложный механизм синтеза запаз­дывающей цепи? На этот вопрос можно ответить положитель­но, если принять во внимание то обстоятельство, что при синте-

 

106

зе в направлении голова—хвост энергию для присоединения следующего нуклеотида несет уже присоединившийся нуклеотид. Если произойдет коррекция, этот нуклеотид будет удален и присоединение следующего станет невозможным. Таким об­разом, синтез в направлении 3'→5' вести нецелесообразно, и плата за это — усложнение механизма синтеза одной из цепей ДНК.

Понятно также, почему затравки состоят не из дезоксирибо-нуклеотидов. Они подлежат удалению, поскольку содержат много ошибок, и «метятся» необычными для ДНК рибонуклеотидами, которые распознаются ДНК-полимеразой как «чужие».

Топоизомеразы. Две цепи ДНК, согласно модели Уотсона — Крика, образуют двойную спираль. Для того чтобы каждая из цепей стала матрицей для синтеза новой цепи, необходимо, что­бы нити ДНК расплелись. Эту функцию в процессе репликации выполняют специальные белки, называемые ДНК-геликазами. Молекула геликазы движется перед ДНК-полимеразным ком­плексом и раскручивает спираль ДНК в репликативной вилке, используя энергию гидролиза АТФ.

При расплетении спирали ДНК в нерасплетенной части должно возникнуть напряжение, которое приведет к положи­тельной суперспирализации и вращению молекул ДНК. Это об­стоятельство было высказано, как аргумент против полуконсер­вативного механизма репликации. В действительности ни вра­щения, ни положительной суперспирализации не происходит. Топологические проблемы «решает» группа ферментов, способ­ных изменять степень спирализации ДНК. Они называются топоизомеразами.

Топоизомеразы типа I могут снимать избыточную спирали-зацию. Они вносят временный разрыв в одну из цепей ДНК в области перед репликативной вилкой и дают, таким образом, спирали ДНК вращаться вокруг своей оси, снимая при этом избыточное напряжение и восстанавливая затем разорванную цепь_;

Другой фермент, топоизомераза типа II, связывается на время с обеими цепями двойной спирали и вносят в нее вре­менный двуцепочечный разрыв, удерживая при этом разорван­ные концы. Благодаря этому ферменту можно распутать слож­ные переплетения и узлы, которые возникают между дочерни­ми молекулами ДНК после их синтеза. Кроме того, такая топоизомераза совершенно необходима при репликации кольце­вых молекул ДНК для разъединения двух дочерних кольцевых молекул.

 

107

 

Важную роль в репликации играет еще один класс белко­вых молекул. Они называются SSB белки, или белки, связы­вающиеся с ДНК. SSB белки, связываясь с одноцепочечной ДНК, делают ее более доступной для ферментов репликации и способствуют дальнейшему расплетению двойной спирали. Белки препятствуют возникновению в одноцепочечной ДНК структур, препятствующих репликации, например, шпилек.

Репликон. Процесс репликации бактериальной ДНК непре­рывен. Начавшись в одной точке, репликация продолжается до тех пор, пока вся ДНК не удвоится. Таким же образом репли­цируются плазмиды бактерий, бактериофаги и вирусы. В смыс­ле репликации все они представлены как единица репликации, которая получила название репликон. Другими словами, их ге­номы представляют собой монорепликонные структуры.

Место, где начинается репликация, называется сайтом ини­циации репликации, или ориджином репликации (оrі). Орид-жин репликации представляет собой определенную последова­тельность нуклеотидов в ДНК- Эта последовательность способ­ствует расплетению ДНК (образуется так называемый «репликационный глаз»), и на ней собирается репликативный комплекс белков. На ориджине может образоваться одна или две репликативные вилки. В первом случае репликация назы­вается однонаправленной, а во втором—двунаправленной. При двунаправленной репликации образуются две репликатив­ные вилки, перемещающиеся в противоположных направлени­ях. Монорепликонные геномы имеют кольцевую структуру, и картина их репликации напоминает греческую букву тета. По­этому структуры ДНК, образующиеся при репликации кольце­вых молекул ДНК, называют θ-структурами.

Специфичность ориджина определяется тем, что его распо­знает специальный белок (или белки), с ним связывающийся и участвующий в инициации синтеза. Сама ДНК-полимераза в инициации синтеза белка не участвует. Она начинает синтез после того, как праймаза синтезирует затравку. У бактерий и некоторых вирусов длина ориджина репликации составляет около 300 нуклеотидных пар (н. п.).

Размер генома эукариот в тысячи раз превосходит размер бактериального генома и представлен несколькими молекулами ДНК, которые сложным образом компактизованы. Вместе с тем, скорость репликации эукариотической ДНК на порядок ниже, чем у прокариот. Репликация происходит в фазе S кле­точного цикла, протяженность которого составляет несколько (5—10) часов. Репликация столь большого количества ДНК за

 

108

столь короткий промежуток времени осуществляется посредст­вом разделения каждой хромосомы на множество отдельных репликонов. Таким образом, в любой момент S-фазы только не­которые из репликонов вступают в репликацию. 

У многих высших эукариот расстояние между соседними точками инициации составляет (1—2)*10⁵ н. п. Это расстояние соответствует среднему размеру репликона. Отсюда следует, что в гаплоидном геноме млекопитающих содержится 20000—30000 репликонов. До сих пор не ясно, как регулируется инициация репликации у столь большого количества реплико­нов. Не ясно также, как репликационный аппарат отличает уже отреплицировавшиеся репликоны от тех, которым предсто­ит реплицироваться, т. е. существует запрет на повторную реп­ликацию в пределах одного клеточного цикла. Иногда этот за­прет нарушается, что приводит к появлению нескольких копий одного и того же участка хромосомы. Такое явление называется амплификацией.

Итак, несмотря на принципиальное сходство механизмов ре­пликации у прокариот и эукариот, последние представляют по-лирепликонную структуру со сложным механизмом регуляции инициации репликонов.

РЕПАРАЦИЯ ДНК

 

Высокая стабильность генетического материала. После рассмотрения процесса репликации ясно, что генетическая ин­формация копируется с исключительно высокой степенью точ­ности. Это связано с тем, что замены оснований в молекуле ДНК могут вызвать мутации, приводящие к нарушениям кле­точных функций и гибели клеток. Следовательно, допустимы низкие частоты возникновения мутаций для сохранения жизни. Таким образом, как зародышевые, так и соматические клетки должны быть надежно защищены от генетических изменений.

Анализ частоты аминокислотных замен показывает, что бе­лок среднего размера, состоящий из 400 аминокислот, изменя­ется случайным образом в результате одной аминокислотной замены приблизительно один раз в 200 000 лет. Некоторые бел­ки настолько консервативны, что даже такая низкая частота изменения аминокислот неприемлема для их нормального функционирования. Например, в молекуле гемоглобина одна замена на каждые 100 аминокислот происходит за 6 млн. лет. Гистон Н4 изменяется в сто раз медленнее. Особи, у которых замены происходят чаще, элиминируются естественным отбо­ром. Это — еще одно подтверждение тому, что сохранение нук-

 

109

 

леотидных последовательностей — необходимое условие сохра­нения жизни.

Между тем нуклеотиды в составе ДНК постоянно подвергаются изменениям, вызванным тепловыми флуктуациями вслед­ствие беспорядочных соударений с окружающими молекулами. Изменения также происходят в результате действия мутагенов, клеточных метаболитов, космической радиации и ультрафиоле­тового облучения (рис. 2.6). Наиболее часто происходит апуринизация — потеря остатков аденина и гуанина из-за разрыва N-гликозидной связи между пурином и дезоксирибозой. За су­тки каждая клетка человеческого организма претерпевает 5000 актов апуринизации. Другое нарушение — дезаминирование цитозина в результате потери аминогруппы, которое происхо­дит в клетке 100 раз в сутки. Дезаминированию подвергаются также другие основания. Многие канцерогены алкилируют (на­пример, метилируют) основания. Иногда может происходить разрыв пуринового кольца. Такое нарушение препятствует реп­ликации. Ультрафиолетовое излучение Солнца вызывает обра­зование димеров тимина за счет образования ковалентной свя­зи между соседними тиминами в одной из цепей ДНК. Нару­шения оснований в ДНК должны исправляться. Процесс ликвидации генетических нарушений называется репарацией.

Прямая и эксцизионная репарация. Наиболее простой путь репарации некоторых повреждений — прямая реактивация. Так, например, фермент метилтрансфераза может переносить метильную или этильную группу с алкилированного основания на один из собственных остатков цистеина. При этом фермент инактивируется, но сохраняет способность регулировать актив­ность собственного гена.

Другой фермент — фотолиаза — репарирует пиримидино-вые димеры, образовавшиеся под действием ультрафиолетового излучения (220—230 нм). В его состав входит короткая молеку­ла РНК (10—15 нуклеотидов), без которой фермент теряет ак­тивность. Фотолиаза способна обнаружить пиримидиновый димер и прочно связаться с ним. В результате облучения образо­вавшегося комплекса видимым светом происходит фотохимиче­ская реакция «расшивания» димера, т. е. разрушение специфических ковалентных связей. В результате этой фотохи­мической реакции восстанавливается нормальная структура ДНК и фермент теряет сродство к ней (рис. 2.7, а).

Прямая реактивация—это частный случай репарации. В клетке также функционирует универсальный механизм репара­ции, который называется эксцизионная репарация (рис. 2.7, б). Ее принцип заключается в следующем. Специфический фер-

110

 

мент удаляет измененное основание. Другой фермент узнает дезоксирибозу, не связанную с основанием, и разрывает фосфо-диэфирный остов с 3'- или с 5'-конца молекулы сахара, не свя­занной с основанием. Следующий фермент удаляет поврежден­ное основание вместе с прилежащими к нему основаниями в той же цепи ДНК. Затем ДНК-полимераза, пользуясь неповре­жденной цепью ДНК как матрицей, синтезирует новый отрезок цепи. ДНК-лигаза завершает репарационный процесс, сшивая

112

остающийся одноцепочечный разрыв. Таким образом, часть од­ной из цепей ДНК, в которой было повреждение, удаляется и затем снова синтезируется в исходном виде, вследствие того, что вторая, неповрежденная, цепь служит матрицей для синте­за отрезка новой цепи. Значит, в процессе репарации, так же как и в репликации, используется механизм матричного синте­за в соответствии с принципом комплементарности.

Ферменты, узнающие дефектные основания в ДНК,называ­ют) ДНК-гликозилазами. У Е. coli , например, существует около 20 различных ферментов этого класса. Каждый из них узнает какой-нибудь один тип измененных оснований и катализирует гидролитическое отщепление такого основания от дезоксирибозы.1 В их число входят ферменты, отщепляющие дезаминирован-ные цитозин или аденин, алкилированные основания различных типов, основания с разомкнутым кольцом и основания, в которых углерод-углеродная связь заменена простой. Практически на каждое аномальное основание, которое может возникнуть в ДНК, существует своя N-гликозилаза.

Дальше в работу вступают АР-эндонуклеазы, разрывающие сахарофосфатный остов в АР (апуриновом или апиримидиновом) сайте. Существует два типа этих ферментов, один из кото­рых разрывает фосфодиэфирную связь с З'-конца, а другая — с 5'-конца от АР-сайта. Затем экзонуклеаза удаляет поврежден­ный участок вместе с неповрежденными нуклеотидами. В неко­торых случаях эту функцию выполняет ДНК-полимераза I, об­ладающая 5'-экзонуклеазной активностью.

Образовавшаяся брешь заполняется новыми нуклеотидами. Эту функцию выполняет ДНК-полимераза I (см. с. 106), вслед за которой в действие вступает ДНК-лигаза.

Следует отметить, что природа оснований такова, что дезаминирование не остается незамеченным, поскольку возникают аномальные основания, распознаваемые ДНК-гликозилазами. Это обстоятельство может объяснить отсутствие урацила в со­ставе ДНК, поскольку спонтанное дезаминирование цитозина дает урацил. Наиболее простой из пуринов — гипоксантин — специфически связывается с цитозином с образованием двух водородных связей. Но гипоксантин — продукт дезаминирования аденина. Гуанин образуется при добавлении к гипок-сантину второй аминогруппы и уже не является продуктом дезаминирования. Так эволюция создала пару Г — Ц с тремя во­дородными связями.

Здесь следует отметить, что процесс репарации может объ­яснить присутствие, казалось бы, избыточной информации в ДНК. Если генетическая информация закодирована в одной из

 

 

113

цепей, то вторую цепь можно рассматривать как резервную, по которой информацию можно восстановить в процессе репара­ции. Лишь в крайнем случае, когда одновременно повреждают­ся оба основания в паре, в клетке не остается правильной ко­пии для репаративного синтеза.

Ряд повреждений ДНК вызывает нарушения двойной спи­рали. К ним относится возникновение под действием ультра­фиолета пиримидиновых димеров или нарушения в результате взаимодействия оснований ДНК с объемистыми углеводорода­ми. Для репарации такого рода повреждений используется не­сколько иной путь. Повреждения распознаются и удаляютсй с участием фермента эндонуклеазы UvrABC. Этот фермент раз­рывает фосфодиэфирные связи с обоих концов поврежденного участка. Затем фермент хеликаза II удаляет поврежденйый участок. Реакция сопряжена с гидролизом АТФ. И, наконец, ДНК-полимераза I застраивает образовавшуюся брешь.

SOS- репарация. В ответ на увеличение повреждений в ДНК клетка может мобилизовать дополнительные репаратив-ные ресурсы. Такая репарация называется индуцируемой. Она используется клеткой, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что жизнь клетки поставлена под угрозу. По­этому систему индуцируемой репарации называют SOS-систе­мой, или системой SOS-репарации.

Индукция SOS-системы тонко настроена. При незначитель­ных повреждениях возрастает уровень некоторых репаративных белков, работавших и до индукции. При увеличении числа по­вреждений блокируется деление клеток (при успешном устра­нении дефектов оно восстанавливается) и включается часть ге­нов SOS-системы. При очень сильном повреждении ДНК вклю­чаются все гены репарации. При SOS-репарации специальные белки подавляют самокорректирующую активность ДНК-поли-меразы III, давая ей возможность удлинять цепь ДНК, послед­ний нуклеотид в которой не спарен с матрицей. Это дает воз­можность провести репликацию на поврежденной ДНК и спа­сти клетку ценой увеличения числа мутаций.

Репарация — процесс достаточно энергоемкий, поэтому ин­дукция SOS-системы происходит только при условиях благо­приятного энергетического баланса клетки. С другой стороны, степень индукции SOS-системы отражает степень неблагополу­чия генома, а значит, и шансы клетки на выживание. Напри­мер, для некоторых умеренных бактериофагов индукция SOS-системы является сигналом для размножения и уничтоже­ния клетки-хозяина, чтобы спастись самому.

 

 

114

В результате ошибок репликации и репарации в ДНК мо­гут находиться некомплементарные пары нуклеотидов. Такие Нарушения также репарируются. Вся сложность здесь заклю­чается в том, как отличить, в какой цепи правильный, а в какой неправильный нуклеотид, подлежащий замене на компле­ментарный правильному. Т. е. нужно уметь отличать старую и новосинтезированную цепи ДНК.

Некоторое время новая цепь ДНК может отличаться от матричной присутствием одноцепочечных разрывов или бре­шей, а также тем, что старая цепь метилирована, а вновь син­тезированная ДНК полуметилирована.

Со временем ДНК метилируется полностью, но пока отли­чие существует, система репарации удаляет неспаренный нук­леотид на неметилированной цепи. Механизм репарации сходен с механизмом эксцизионной репарации.

Еще одни механизм репарации связан с рекомбинацией и будет рассмотрен в следующем параграфе.

 

 

РЕКОМБИНАЦИЯ

 

Механизм генетической рекомбинации включает в себя мо­лекулярные процессы, которые приводят к перераспределению нуклеотидных последовательностей. Рекомбинация обусловли­вает большое число разнообразных биологических явлений. Од­нако события, приводящие к рекомбинации, делятся на два больших класса. Это общая рекомбинация и сайт-специфиче­ская рекомбинация.

Общая, или гомологичная, рекомбинация. Этот тип реком­бинации характерен для всех живых организмов. При гомоло­гичной рекомбинации происходит обмен участками гомологич­ных, т. е. близких по нуклеотидной последовательности участков молекул ДНК- Классический пример общей рекомбина­ции— обмен участками гомологичных хромосом в мейозе.

У разных организмов последовательность событий, приводя­щих к рекомбинации, может быть различной, но в целом ре­зультаты общей рекомбинации всегда одинаковые: I) две гомо­логичные двойные спирали разрываются, и концы одного гомо­лога соединяются с концами другого так, что получаются две спирали ДНК со взаимозамещенными участками; 2) точка об­мена может находиться в любом участке гомологичных молекул ДНК; 3) в точке обмена две молекулы ДНК соединяются сту­пенчато, а длина ступеньки может составлять до нескольких тысяч пар оснований; 4) в точке обмена ни один нуклеотид не

 

115

 

 

исчезает, не добавляется и не превращается в другой нуклеотид, т. е. гомологичная рекомбинация внутри гена не приведет к потере его активности за счет мутации или сдвига рамки считывания.

Гомологичная рекомбинация происходит через образование промежуточного соединения, называемого структурой Холидея, или полухиазмой. Этот этап включает обмен цепями ДНК с их перекрещиванием (рис. 2.8). Сначала происходит разрыв в од­ной из цепей ДНК. В районе разрыва ДНК деспирализуется, и образуется одноцепочечный участок со свободным концом. Эта одноцепочечная ДНК «находит» комплементарную область в го­мологичной молекуле ДНК и образует с ней двойную спираль, вытесняя при этом одноцепочечный участок гомологичной моле­кулы. Последний, в свою очередь, взаимодействует со свободным комплементарным участком гомологичной молекулы, в котором произошел инициирующий разрыв. Таким образом, две молеку­лы ДНК обмениваются одноцепочечными комплементарными участками с образованием гетеродуплексной ДНК.

Образовавшаяся структура обладает двумя важными свой­ствами. Точка обмена между двумя гомологичными цепями (точка скрещивания) может перемещаться вдоль гомологичных молекул, увеличивая или уменьшая гетеродуплексный участок. Такой процесс называется миграцией ветвей. Второе свойство заключается в том, что полухиазма может существовать в раз­личных изомерных формах, возникающих при вращении состав­ляющих элементов друг относительно друга. В результате две ранее перекрещивающиеся цепи становятся неперекрещиваю-щимися и наоборот.

Для разделения гетеродуплекса в каждой из перекрещи­вающихся цепей должен произойти разрыв. В зависимости от того, в каком из изомерных состояний находилась полухиазма во время разрыва, могут возникнуть два типа обменов. В од­ном случае окажется, что рекомбинирующие молекулы обменя­лись сравнительно короткими одноцепочечными участками, об­разовавшими гетеродуплексные районы. При другом способе рекомбинации часть каждой исходной спирали ДНК окажется присоединенной (ступенчатым соединением) к части другой спирали. Такой обмен называют собственно рекомбинацией.

Если рекомбинация пошла по первому пути, т. е. привела к образованию гетеродуплексных районов, то судьба последних может быть двоякой. Если неспаренные основания гетеродуп­лекса не репарируются, то после репликации в образовавшихся молекулах ДНК возникнут двуцепочечные участки из гомоло­гичной молекулы ДНК, вступившей в обмен. В случае рекомби-

 

 

116

нации в мейозе это приведет к постмейотическои сегрегации (см. ниже). Если же репарация неспаренных оснований про­изойдет, то генетическая информация в обеих цепях бывшего гетеродуплекса станет идентичной, и один из возможных про­дуктов рекомбинации исчезнет и превратится в другой. Такой вариант рекомбинации называют генной конверсией.

Ферменты, осуществляющие общую рекомбинацию. У ки­шечной палочки общая рекомбинация зависит от белков — про­дуктов генов rec. Ключевую роль в обмене комплементарными цепями между рекомбинирующими молекулами и в образова­нии структуры Холидея играет гесА белок — продукт гена гесА. (Этот же белок активно участвует в процессе репарации.) Белок гесА стимулирует спаривание оснований между отдель­ной цепью ДНК и комплементарной ей цепью в двуспиральной молекуле ДНК- В результате образуется так называемая D-петля. Реакция получила название поглощение, или ассими­ляция, цепи. Ассимиляция требует гидролиза АТФ и при нали­чии одного мономера АТФ на каждые 5—10 нуклеотидов одно-цепочечной ДНК идет в оптимальном режиме.

Белок гесА покрывает одноцепочечную ДНК, и такой ком­плекс связывается с двуцепочечной ДНК. Однонитиевая ДНК перемещается вдоль гетеродуплекса, пока не будет найден уча­сток гомологии. Затем происходит замена одной цепи на дру­гую, причем перенос начинается с З'-конца ассимилирующей молекулы и идет в направлении 3'→5'. Иначе говоря, с участи­ем белка гесА белок способен обменивать цепи между двумя гомологичными двуцепочечными молекулами ДНК, осуществ­ляя миграцию структуры Холидея.

Для действия гесА белка необходим свободный конец одно-цепочечной ДНК. Образование одноцепочечных концов у Е. coliнаиболее эффективно происходит с участием продуктов генов гесВ и гесС, которые представляют две из трех субъединиц од­ного фермента — экзонуклеазы V, или нуклеазы recBCD. Эта нуклеаза активируется при наличии двуцепочечных концов ДНК, которые могут возникать при облучении, при случайном разрыве матричной цепи в репликативной вилке или при пере­носе ДНК из клетки в клетку при конъюгации. Нуклеаза recBCD, присоединившись к двуцепочечному концу, движется вдоль молекулы ДНК и, подобно геликазам, расплетает двой­ную спираль, используя при этом энергию гидролиза АТФ.

Расплетенная ДНК после прохождения фермента может ре-натурировать, но скорость ренатурации меньше скорости расплетения. Таким образом, по мере продвижения нуклеазы recBCD на ДНК образуются растущие однонитиевые петли.

 

118

Если фермент встречает на своем пути определенную нуклеотидную последовательность, называемую χ-сайтом, он вносит в нее одноцепочечный разрыв. В результате одна из петель пре­вращается в длинный однонитиевый «хвост», который может быть использован гесА белком для инициации гомологичной ре­комбинации.

Одноцепочечные разрывы возникают под действием многих факторов, в частности γ-лучей и рентгеновских лучей. Указан­ные воздействия могут также инициировать генетическую ре­комбинацию. Например, в клетках позвоночных в S- и G-фазах митотического цикла эти факторы индуцируют обмены между двумя сестринскими хроматидами каждой хромосомы, которые можно наблюдать с помощью особой методики окрашивания хромосом.

RecAи recDCD белки действуют кооперативно с SSB бел­ком, который предохраняет одноцепочечную ДНК от действия нуклеаз и облегчает реакции спаривания. Мутации по гену ssb заметно ослабляют рекомбинацию.

Рекомбинация завершается разрезанием полухиазмы. Ка­кие ферменты отвечают за эту реакцию у Е. coli , не ясно. Од­нако специализированные ферменты, специфически разрезаю­щие структуру Холидея, удалось выделить из клеток, заражен­ных фагом Т4 или Т7.

В гомологичной рекомбинации могут принимать участие и топоизомеразы. Например, образование D-петель существенно облегчается, если ДНК имеет отрицательную сверхспирализацию, которую создает ДНК-гираза. С участием топоизомеразы I две рекомбинирующие молекулы могут комплементарно спа­риваться в отсутствии свободных одноцепочечных концов.

Участие рекомбинации в репарационных процессах. Нали­чие повреждений в ДНК активирует системы репарации и ре­комбинации. По крайней мере, у бактерий эти два процесса связаны между собой. Репарация некоторых типов поврежде­ний вообще невозможна без образования гомологичного дуп­лекса ДНК и может происходить только рекомбинационным путем (рис. 2.7, В).

При репликации в ДНК возникают одноцепочечные разры­вы и бреши. Это происходит, когда репликативная вилка про­двигается через поврежденный участок ДНК до того, как репа-ративные системы успели устранить повреждение. Одна из це­пей в таком случае окажется дефектной, и комплементарная цепь напротив поврежденного участка не будет синтезирована. Чтобы репарировать образовавшуюся брешь, нужно использо-

 

119

вать и качестве эталона второй полученный при репликации дуплекс ДНК- Это возможно при гомологичной рекомбинации. Как видно из рис. 2.7, в, и поврежденная, и недореплицированная ДНК при рекомбинации окажутся в дуплексе с неповреж­денной ДНК и могут быть репарированы обе. Аналогично, за счет гомологичной рекомбинации, и только за счет нее, проис­ходит репарация двуцепочечных разрывов.

Рекомбинация может происходить между гомологичными генами соматических клеток или при вегетативном росте одно­клеточных эукариот. Большинство случаев такой митотической рекомбинации связаны с репарацией. С точки зрения репара­ции можно объяснить возникновение сестринских хроматидных обменов, которые так же, как и митотическая рекомбинация, стимулируются воздействиями, повреждающими ДНК- Обмен сестринскими хроматидами есть не что иное, как обмен между идентичными копиями одной и той же хромосомы. Однако с ре­парационной точки зрения, такой обмен может исправлять од­но- и двуцепочечные разрывы.

Ферментативный аппарат, осуществляющий рекомбинацию у эукариот, пока не известен. Есть данные, указывающие, что центральную роль в рекомбинации должен играть белок, по­добный гесА белку. Такой белок выделен у низших эукариот. Выделен также белок дрожжей, способный разрезать полухи­азмы и по свойствам напоминающий аналогичные белки фагов Т7 и Т4.

Мейотическая рекомбинация. В мейозе у эукариот гомоло­гичные хромосомы, полученные от родителей, расходятся по разным клеткам. Перед расхождением гомологичные хромосо­мы спариваются на всем своем протяжении и образуют в про­фазе первого деления мейоза особую структуру—синаптоне-мальный комплекс. Считается, что эта структура способствует рекомбинации между гомологами. Такой рекомбинационный обмен, кроссинговер, играет в мейозе важную роль. Места свя­зывания хромосом называются хиазмами. В первом делении мейоза хиазмы, возникшие в результате гомологичной рекомби­нации, выполняют роль центромер в митозе. Результатом мейо-тической рекомбинации может быть как генная конверсия, так и постмейотическая сегрегация. Значит, этот вид рекомбинации проходит через образование полухиазм и гетеродуплексных участков. Кроме обеспечения нормального расхождения гомо­логов, мейотическая рекомбинация играет очень важную эво­люционную роль, которая будет рассмотрена ниже.

Специализированные системы гомологичной рекомбина­ции. Выше были описаны системы рекомбинации, выполняю-

 

120

щие общие функции. Однако существуют и специализирован­ные системы гомологичной рекомбинации, обеспечивающие вполне определенные частные процессы. На одной из таких систем мы остановимся подробнее.

Многие паразиты для борьбы с иммунной системой организ­мов-хозяев используют систему общей рекомбинации. Так, у го­нококков— бактерий, вызывающих гонорею, на поверхности клеток есть ворсинки — пили. Пили являются одним из основ­ных факторов вирулентности: они обеспечивают прикрепление гонококков к клеткам эпителия мочеполовой системы. Пили со­стоят из белка — пилина. В геноме бактерий много генов, коди­рующих иммунологически различные варианты пилина. Однако экспрессируется только тот ген, который находится в области ріlЕ. Он и определяет, какой пилин представлен на поверхно­сти клетки.

Довольно часто в результате утраты гена ріlЕ бактерия ли­шается пилей. Однако в результате гомологичной рекомбина­ции один из альтернативных генов пилина, находящийся в дру­гом локусе (pilS), «перемещается» в локус pilE. Рекомбинация идет в результате взаимодействия «остатков» прежнего гена и гомологичных нуклеотидных последовательностей гена из локу-са pilS. Таким образом, бактерии меняют иммунологические свойства пилей и не позволяют развиться эффективному им­мунному ответу.

Подобную «стратегию» использует возбудитель возвратно­го тифа Во relli а, который за счет гомологичной рекомбинации меняет структуру поверхностного белка, распознаваемого им­мунной системой человека. Эукариотический болезнетворный агент — возбудитель сонной болезни Tripanosomabruseiис­пользует тот же способ ускользания от действия защитных средств организма.

Сайт-специфическая рекомбинация. Этот тип рекомбинации не требует протяженных участков гомологии: в рекомбинационное событие вовлекаются специфичные последовательности нуклеотидов и специальный ферментативный аппарат. В пре­делах рекомбинирующих последовательностей имеется корот­кая область гомологии, присутствие которой хотя и необходимо, но недостаточно для осуществления рекомбинации. В каждом конкретном случае сайт-специфическая рекомбинация выпол­няет строго определенную функцию, а нуклеотидные последо­вательности, вовлекаемые в обмен, и ферменты специфичны для каждого случая. Однако в общих чертах механизм сайт-специфической рекомбинации всегда одинаков.

 

121

 

В качестве примера опишем процесс интеграции генома фа­га λв бактериальную хромосому (рис. 2.9). ДНК фага может проходить один из двух жизненных циклов: литический и лизогенный. В литическом цикле фаговая ДНК существует в инфи­цированной бактерии в виде независимой кольцевой молекулы. Когда бактерия находится в лизогенном состоянии, фаговая ДНК представляет собой составную часть бактериальной хро­мосомы и называется профагом. Для лизогенизации бактерии свободная ДНК фага должна внедриться в ДНК клетки-хозяи­на. При выходе из лизогенного состояния происходит обратный процесс — исключение профага из хромосомы бактериальной клетки.

Интеграция и исключение фаговой ДНК происходит в ре­зультате рекомбинации, которая осуществляется в специфиче­ских областях (локусах) бактериальной и фаговой ДНК. Эти локусы названы сайтами присоединения, или att-сайтами. Сайт присоединения на бактериальной хромосоме обозначается как attB и состоит из нуклеотидной последовательности, которую можно представить в виде трех компонентов ВОВ'. Сайт при­соединения на фаговой ДНК обозначается attP и также пред­ставлен тремя компонентами POP'. Последовательность, обо­значенная О, является общей для attB и attP и представляет собой сайт рекомбинации между ними.

После внедрения фаговой ДНК в хромосому профаг ограни­чен двумя новыми att-сайтами, которые обозначаются attL и attR. Каждый из этих сайтов также состоит из трех компонен­тов: сайт attL представлен последовательностями ВОР', а сайт attR — РОВ'. Видно, что в результате интеграции происходит перекомбинация исходных последовательностей. Таким обра­зом, при интеграции и при исключении фаговой ДНК взаимо­действуют различные последовательности нуклеотидов. Разли­чаются и белки, осуществляющие эти две реакции. Интеграция требует продукта фагового гена int и бактериального белка INT. Реакция исключения помимо двух указанных белков тре­бует продукта фагового гена XIS.

Последовательность О является общей для всех сайтов. Именно по этой области гомологии и происходит кроссинговер. Она называется сердцевинной или кор-последовательностью. Фланкирующие (примыкающие) ее области В,В' и Р,Р' рас­сматриваются по отношению к ней как отличающиеся друг от друга «плечи».

Удалось расшифровать последовательности att-сайтов. Все они представляют собой АТ-богатые области, включающие об-

 

 

122

щую последовательность из 15 пар оснований. Показано, что при рекомбинации в одинаковых коровых последовательностях происходят ступенчатые разрезы. При этом образуются ком­плементарные одноцепочечные концы, которые могут быть ис­пользованы в перекрестной гибридизации. Подобная реакция происходит между «липкими» концами, образующимися под действием некоторых рестриктаз. Длина «уступа» в результате ступенчатого разрезания кор-последовательности составляет пять или семь нуклеотидов. Таким образом, во время рекомби­нации обе цепи двойной спирали ДНК бактериофага на время разрываются и соединяются с концами точно таких же разо­рванных цепей двойной спирали бактериальной ДНК.

Фермент, ответственный за эту реакцию (продукт фагового гена int), называют лямбда-интегразой. С его участием проис­ходит тесное сближение участков обмена и инициируются необ­ходимые реакции разрыва и воссоединения ДНК. Сайты связы­вания белка INT расположены рядом с сайтами связывания белка inf. Оба белка покрывают большую часть последователь­ности attP.

Выщепление профага из клеточной хромосомы — это также результат сайт-специфической рекомбинации, но на этот раз между участками ВОР и РОВ, которые находятся на концах интегрированной вирусной ДНК. Эта реакция также асиммет­рична и идет с участием дополнительного белка (продукта гена xis). В отсутствие этого белка фаговая интеграза не способна взаимодействовать с сайтом attR. Комплекс, образованный белками INT и X1S в сайте attR, способен спариваться с ком­плексом, образованным белком INT в сайте attL.

В некоторых случаях происходит так называемая незаконная рекомбинация. В результате образуются дефектные фаговые частицы, у которых часть фаговой ДНК замещена прилежащей бактериальной ДНК. Перенос бактериальных генов с помощью таких фагов получил название трансдукции. До разработки ме­тодов рекомбинантных ДНК трансдуцирующие фаги использо­вали для выделения генов, примыкающих к att-сайту.

Роль рекомбинации в эволюции. Кроме непосредственных функций, которые выполняет рекомбинация в клетке, она игра­ет важную роль в эволюции организмов. В животном мире су­ществуют те или иные способы обмена генетическим материа­лом. У эукариот главным способом, обеспечивающим рекомби­нацию, служит половое размножение. В результате мейотической рекомбинации формируются разнообразные соче­тания генов. Таким образом, создается возможность отбора благоприятных комбинаций генов, т. е. геномов. В отсутствие

 

124

рекомбинации генетический материал каждой хромосомы был бы фиксирован в ее аллелях и размер мишени для мутацион­ных повреждений увеличился бы от одного гена до целой хро­мосомы. В результате перераспределения генов полезные мута­ции отделяются от вредных и проверяются в новых сочетаниях. Таким образом, благодаря рекомбинации, хромосому, с эволю­ционной точки зрения, можно рассматривать как структуру, со­стоящую из временно связанных аллелей.

Рекомбинация может приводить к возникновению мульти-генных семейств, состоящих из генов со сходными, но различ­ными функциями. Рекомбинация способствует также «унифи­кации» множественных высокогомологичных генов (например, генов, кодирующих гистоны). С другой стороны, рекомбинация обеспечивает перераспределение ограниченного числа генов, что значительно увеличивает число комбинаций, которые они могут создавать (например, гены иммуноглобулинов).

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

Носителем генетической информации является ДНК. Эта информация «переписывается» на молекулу РНК, а последняя, в свою очередь, служит матрицей для синтеза молекулы белка. Значит, в ДНК записана информация о структуре белковых молекул, и посредником при передаче этой информации высту­пает молекула РНК.

Белковые молекулы образуют сложные пространственные структуры, но общий принцип их организации заключается в том, что структуры высшего порядка определяются непосредст­венно структурой низшего порядка, т. е. последовательностью аминокислот в белковой молекуле. Таким образом, в молекуле ДНК записана информация о первичной структуре белковой молекулы (рис. 2.10).

ДНК представляет собой однородную по длине двуцепочеч-ную молекулу, и ее структура не зависит от последовательно­сти пар оснований. Значит, последовательность оснований в полинуклеотидной цепи имеет значение не для самой структуры ДНК- С точки зрения структуры ДНК именно эта последова­тельность и несет информацию о последовательности аминокис­лот в белковой молекуле. Ген и его продукт коллинеарны. В со­став ДНК входят четыре азотистых основания, а белковые мо­лекулы включают 20 различных аминокислот. Каким же образом на четырехбуквенном языке нуклеотидов записана ин­формация о двадцатибуквенном языке аминокислот? Это и есть проблема генетического кода. Иными словами, генетический

 

 

125

 

код устанавливает взаи­моотношения между по-

следовательностью нук-

леотидов в ДНК и по­следовательностью ами­нокислот в молекуле белка.

Генетические исследо­ вания. Поскольку амино­кислот больше, чем нук-

леотидов, каждая ами­нокислота должна коди­роваться определенной комбинацией нуклеотидов, называемой кодоном. Число нуклеотидов, определяющих амино­кислоту, соответствует кодовому отношению. Минимальное кодовое отношение должно рав­няться трем, так как двух нуклеотидов для кодирования аминокис­лот недостаточно, по­скольку число комбина­ций двух нуклеотидов равно 16, а аминокислот — 20. Число комбинаций из трех нуклеотидов составляет четыре, т. е. 64. Этого вполне достаточно, чтобы закодировать все аминокислоты. С другой стороны, избыточное число трипле­тов предполагает, что либо не все триплеты участвуют в коди­ровании аминокислот, либо одна и та же аминокислота может кодироваться несколькими триплетами, т. е. генетический код вырожден.

Идея триплетности кода была высказана в 1954 г. в статье известного физика Г.А. Гамова.

Наиболее простой способ кодирования состоит в том, что триплетные кодоны расположены друг за другом и считываются по­следовательно. Однако были высказаны предположения, что ко­доны могут перекрываться, а следовательно, данное основание может входить в состав более чем одного кодона и определять бо­лее чем одну аминокислоту. В таком случае набор возможных со­седей каждой аминокислоты в молекуле белка должен быть огра-

 

126

 

ничен. Гамов исследовал известные к тому времени аминокислот­ные последовательности и показал, что не существует аминокислот, которые никогда не встречаются рядом.

Окончательно неперекрываемость кода была доказана при исследовании последовательности аминокислот белка оболочки мутантов вируса табачной мозаики. Было показано, что в ре­зультате мутации, вызывающей замену оснований, синтезиру­ется белок с одной изменённой аминокислотой.

Экспериментальное подтверждение триплетной природы ко­да было получено в начале 60-х годов в генетических экспери­ментах, проведенных С. Бреннером и Ф. Криком. Исследования проводились на бактериофаге Т4. С помощью акридинов были получены мутанты со вставками или делециями (выпадениями) нуклеотидов ДНК. Проведенные скрещивания показали, что вставка или выпадение одной пары нуклеотидов обязательно приводит к образованию аномальных белков с нарушенной функцией. К такому же эффекту приводит вставка или делеция двух пар нуклеотидов в пределах одного гена. Если же внутри небольшой области гена происходит три вставки или делеции, синтезируемый белок часто сохраняет активность.

Неперекрываемость кодонов означает, что в зависимости от стартовой точки возможны три варианта считывания генетиче­ской информации. Если для считывания используется только од­на рамка, то при добавлении или удалении одного или двух нук­леотидов происходит сдвиг «рамки считывания». При этом нуклеотидная последовательность в новой рамке будет совершенно иной и в ней будет закодирована последовательность аминокис­лот, лишенная функционального смысла. В случае трех вставок или делеций активность белка восстанавливается. При этом происходит добавление и потеря одной аминокислоты, но рамка считывания восстанавливается (рис. 2.11, а). Измененная часть белка ограничена участком между крайними мутациями.

Таким образом были установлены основные свойства гене­тического кода: 1) каждую аминокислоту кодирует определен­ная комбинация из трех нуклеотидов (кодон), т. е. код трипле-тен; 2) кодоны не перекрываются, а следуют друг за другом без «знаков препинания»; 3) последовательность оснований читает­ся последовательно, начиная со строго определенной (фиксиро­ванной) стартовой точки, т. е. генетическая информация запи­сана только в одной из рамок считывания (за редкими исклю­чениями, которые мы рассмотрим позже).

Расшифровка генетического кода. Решающую роль в рас­шифровке генетического кода сыграли два подхода, которые реализуются с участием бесклеточной системы белка. Бескле­точная система синтеза белка была получена из Е. collв ре-

127

 

зультате механического разрушения клеток и последующего центрифугирования для осаждения обрывков клеточной стенки и клеточной мембраны. В результате получили клеточный экс­тракт, содержащий необходимые компоненты для синтеза бел­ка (ДНК, мРНК, тРНК, рибосомы, ферменты и другие компо­ненты клетки). При добавлении в такую систему АТФ, ГТФ и аминокислот — предшественников белков было обнаружено, что идет синтез белка и добавленные аминокислоты включают­ся во вновь синтезированные белковые молекулы. Если с помо­щью фермента дезоксирибонуклеазы разрушить ДНК-матрицу для синтеза мРНК, то через несколько минут синтез белка пре­кращается, поскольку имеющиеся в системе мРНК имеют ко­роткое время жизни.

М. Ниренберг и X. Маттеи обнаружили, что если в систему добавить препарат мРНК, то синтез белка возобновляется. Та­ким образом от того, какая матрица будет добавлена в бескле­точную систему, можно получить белковые молекулы, амино­кислотная последовательность соответствует последовательно­сти нуклеотидов в добавленной матрице. Для синтеза матрицы был использован фермент полинуклеотидфосфорилаза. Этот фермент катализирует синтез полирибонуклеотидов из рибо-нуклеозиддифосфатов в отсутствие ДНК. Состав РНК, синтезируемый этим ферментом, определяется соотношением рибонуклеотидов в инкубационной смеси, а их последовательность близка к случайной.

Первым синтезированным полирибонуклеотидом был поли (Ү). Его получили при инкубации концентрированного раствора УДФ в присутствии фермента. Оказалось, что при добавлении поли (Ү) в бесклеточную систему синтеза белка синтезируется исключительно полифенилаланин. Так в 1961 г. был расшифро­ван первый кодон. Вскоре было показано, что поли (А) вызыва­ет синтез полилизина, а поли (Ц) — полипролина. Поли (Г) в качестве матрицы не работает, так как образует сложную спи­ральную структуру.

Определение состава кодонов с помощью случайных сопо­лимеров. Следующим шагом в расшифровке генетического ко­да было использование в качестве матриц полирибонуклеоти­дов, синтезированных в присутствии двух рибонуклеотиддифос-фатов, причем последние были взяты в разной пропорции. В такой смеси синтезируется матрица, содержащая все кодоны, которые могут быть образованы в данной системе, но различ­ные кодоны присутствуют с разной частотой в зависимости от соотношения предшественников в реакционной смеси. Напри­мер, случайный сополимер У и Г содержит восемь различных триплетов (табл. 2.1) и их относительная частота зависит от со­отношения У и Г в смеси.Таблица2.1.

Таблица кодонов РНК

 

Стандартный генетический код
1-е осно- вание (5'-ко- нец)	2-е основание								3-е осно- вание (3'-ко- нец)
	U (T)		C		A		G
U (T)	UUU	(Phe/F) Фенил- аланин	UCU	(Ser/S) Серин	UAU	(Tyr/Y) Тирозин	UGU	(Cys/C) Цистеин	U (T)
	UUC		UCC		UAC		UGC		C
	UUA	(Leu/L) Лейцин	UCA		UAA	Стоп (Охра)	UGA	Стоп (Опал)	A
	UUG		UCG		UAG	Стоп (Янтарь)	UGG	(Trp/W) Триптофан	G
C	CUU		CCU	(Pro/P) Пролин	CAU	(His/H) Гистидин	CGU	(Arg/R) Аргинин	U (T)
	CUC		CCC		CAC		CGC		C
	CUA		CCA		CAA	(Gln/Q) Глутамин	CGA		A
	CUG		CCG		CAG		CGG		G
A	AUU	(Ile/I) Изолейцин	ACU	(Thr/T) Треонин	AAU	(Asn/N) Аспарагин	AGU	(Ser/S) Серин	U (T)
	AUC		ACC		AAC		AGC		C
	AUA		ACA		AAA	(Lys/K) Лизин	AGA	(Arg/R) Аргинин	A
	AUG[A]	(Met/M) Метионин	ACG		AAG		AGG		G
G	GUU	(Val/V) Валин	GCU	(Ala/A) Аланин	GAU	(Asp/D) Аспарагиновая кислота	GGU	(Gly/G) Глицин	U (T)
	GUC		GCC		GAC		GGC		C
	GUA		GCA		GAA	(Glu/E) Глутаминовая кислота	GGA		A
	GUG		GCG		GAG		GGG		G

129

 

____

неполярный

полярный

основный

кислотный

(стоп-кодон)терм

^A Кодон AUG кодирует метионин и одновременно является сайтом инициации трансляции: первый кодон AUG в кодирующей области мРНК служит началом синтеза белка ^[1] .

Расшифровка завершена в 1966 году ^[2] .

____ Анализ аминокислотного состава синтезированных в присут­ствии матрицы полипептидов показывает относительную часто­ту включения той или иной аминокислоты. Сопоставление час­тоты образования разных кодонов и включения разных амино­кислот дает информацию о нуклеотидном составе кодонов, но не о последовательности нуклеотидов в кодоне. Например, из данных табл. 2.1 был сделан вывод, что валин, лейцин и цистеин кодируются кодонами, содержащими 2У и 1 Г, а триптофан и глицин — 1У и 2Г.

В результате использования различных сополимеров из двух и трех нуклеотидов был установлен состав кодонов для каждой из аминокислот.

Использование сополимеров с заданной последовательно­стью. Сочетая методы органической химии и ферментативные методы Г. Корана, удалось синтезировать полирибонуклеотиды с определенной повторяющейся последовательностью. Были син­тезированы сополимеры, в которых многократно повторяется по­следовательность из двух, трех и четырех оснований. Использо­вание таких матриц для синтеза полипептидов в бесклеточной системе дало возможность установить точную корреляцию меж­ду кодонами и аминокислотами в полипептиде. Например, сопо­лимер, в котором повторяется последовательность из двух нук­леотидов У и Г, содержит два чередующихся кодона УГУ и ГУГ (см. рис. 2.11, б). При использовании такой матрицы синтезиро­вался полипептид, в котором валин сочетался с цистеином. Этот результат однозначно подтверждает триплетность генетического, кода и в сочетании с данными, полученными другими методами, дает возможность точно идентифицировать кодоны для валина и цистеина (УГУ и ГУГ соответственно).

Если матрица состоит из повторяющейся лоследовательности из трех оснований, то в зависимости от рамки считывания мож­но получить три равных гомополипептида (см. рис. 2.11, б). На­пример, на матрице поли (УУГ) синтезировались полифенилаланин, полисерин и полилейцин. В сочетании с другими экспери-

 

 

130

 

ментами выяснилось, что УУГ кодирует фенилаланин, УГУ— серин, ЦУУ — лейцин. В некоторых случаях на подобных матри­цах синтезировались не три, а два гомополипептида. Такими, например, были матрицы поли (ГУА) и поли (ГАУ). Причину этого мы рассмотрим позже.

Интересные данные были получены на матрицах, состоя­щих из повторяющегося тетрануклеотида. В этом случае должны синтезироваться полипептиды с повторяющейся по­следовательностью из четырех аминокислот. На матрице поли (УАУЦ) шел синтез полипептида с повторяющейся последова­тельностью тирозин—лейцин—серин—изолейцин независимо от рамки считывания (см. рис. 2.11, б). Достаточно знать ко-дон для одной из аминокислот, чтобы определить остальные. Однако совершенно иные результаты были получены при ис­пользовании поли (ГУАА) и поли (АУАГ) (см. рис. 2.11, б). Продуктами реакции были только ди- и трипептиды. Это свя­зано с тем, что три из 64 кодонов не кодируют аминокислот, а выполняют роль терминаторов белкового синтеза. В первом случае синтез останавливался на кодоне УАА, во вто­ром — на кодоне УАГ. Именно по этой же причине на матри­цах поли (ГУА) и поли (ГАУ) синтезировалось только два го-мопептида. Одна из рамок считывания соответствует стоп-кодону (УГА и УАГ, соответственно).

Метод связывания рибосом. Ниренберг и Ледер разработа­ли в 1964 г. другой метод расшифровки кодонов. Они установи­ли, что тринуклеотиды стимулируют связывание с рибосомами тРНК, которая, в свою очередь, связана с аминокислотой, соот­ветствующей данному тринуклеотиду. Это имитирует процесс взаимодействия кодона с антикодоном, который происходит на рибосомах между тРНК и мРНК. Таким образом, связывая ри­босомы на нитроцеллюлозных фильтрах, можно выделить трой­ные комплексы: тринуклеотид — аминоацил-тРНК (в комплексе с аминокислотой) —рибосома. Не связанные с рибосомами мо­лекулы тРНК проходят через фильтр и на фильтре можно об­наружить ту аминокислоту, которая связана стринуклеотидом, добавленным к смеси.

Тринуклеотид добавляли в реакционную смесь, где одна из аминокислот, связанных с тРНК, была радиоактивно мечена. В эксперименте анализировали 20 проб, в которых находился один и тот же тринуклеотид. Определив, в которой из проб мет­ка окажется связанной с фильтром, устанавливают соответст­вие триплета и аминокислоты.

Два описанных выше метода привели к полной расшифров­ке генетического кода в 1966 г. Огромная по объему и выдаю-

 

 

131

щаяся по значению работа была  выполнена всего за 5 лет. Полностью генетический код приведен в табл. 2.1.

Основные свойства генетического кода. 1. Триплетн о с т ь . Была доказана в генетических экспериментах и под­тверждена в биохимических экспериментах. Одна аминокисло­та задается последовательностью из трех нуклеотидов, назы­ваемой кодоном.

2. Код не перекрывается. Кодоны следуют друг за другом без знаков препинания. Иными словами, два кодона не имеют общих нуклеотидов. В цепи ДНК, таким образом, су­ществуют три рамки считывания и генетическая информация записана, как правило, в одной из них. Следовательно, считы­вание информации начинается со строго фиксированного нук-леотида, который и задает нужную рамку.

3. Код вырожден.Из табл. 2.1 видно, что 61 кодон ко­дирует 20 аминокислот, и три кодона служат сигналами для ос­тановки белкового синтеза. Таким образом, код в высокой сте­пени вырожден, т. е. большинство аминокислот кодируется бо­лее чем одним кодоном, а каждый кодон обозначает только одну аминокислоту. Следовательно, по аминокислотной после­довательности можно однозначно определить последователь­ность нуклеотидов, которыми она закодирована. Обратная про­цедура из-за вырожденности кода невозможна.

Кодоны, соответствующие одной и той же аминокислоте, назы­ваются кодонами-синонимами. Метионин и триптофан кодируют­ся одним кодоном, остальные аминокислоты имеют от 2 до 6 кодонов-синонимов. Интересно, что число кодонов для каждой ами­нокислоты коррелирует с реальной частотой встречаемости данной аминокислоты в белках (исключение составляет аргинин).

Большинство синонимов различается только последним ос­нованием триплета. Поэтому говорят, что код вырожден по третьему основанию.

Например, кодоны с одним из двух пиримидинов (Ц или У) в третьем положении всегда являются синонимами, а кодоны с одним из двух пуринов (А или Г) чаще (но не всегда) кодируют одну и ту же аминокислоту. Различия по всем трем основаниям наблюдаются лишь в редких случаях (например, УЦГ и АГУ оба кодируют серии). Ф. Криком для объяснения вырожденно­сти по третьему основанию в кодоне была предложена гипотеза «качания».

В структуре кода находят отражение и химические свойства разных аминокислот. Сходные по свойствам аминокислоты ко­дируются кодонами, имеющими общие основания. Например, все кодоны с У во втором положении кодируют аминокислоты с

 

132

гидрофобной боковой цепью. Если исключить терминирующие кодоны, то наличие А во втором положении определяет поляр­ную или заряженную боковую цепь.

Можно полагать, что биологический смысл вырожденности генетического кода состоит в том, что эффект мутаций сводится к минимуму. При такой организации кода случайно возникшая замена основания с большей вероятностью, чем при случайном подборе кодонов, приведет к замене на сходную аминокислоту или же замены не произойдет вовсе.

Вырожденностью кода можно также объяснить существен­ную разницу в содержании АТ-пар у прокариот (от 30 до 70%) при схожем спектре белков. По-видимому, разные организмы систематически используют различные кодоны-синонимы.

4. Кодуниверсален. Генетический код был расшиф­рован в результате исследований в бесклеточных системах, по­лученных из бактерий. Поэтому следовало подтвердить, что ре­зультаты, полученные invitro, справедливы и invivo. Первые доказательства были получены при анализе мутаций. Было по­казано, что мутации, вызывающие замены оснований, соответ­ствуют аминокислотным заменам в белке. Анализ мутаций, вы­зывающих сдвиг рамки, также выявил соответствие между из­мененным составом кодонов и последовательности аминокислот в «испорченном» участке белка.

Одинаков ли код у живых организмов? Были разработаны гетерологичные системы трансляции, которые позволяют исполь­зовать белоксинтезирующии аппарат одного вида для синтеза белка на мРНК другого вида. Успешное применение таких сис­тем свидетельствует о постоянстве кода. Прямое доказательство универсальности было получено при сравнении нуклеотидных последовательностей ДНК и соответствующих аминокислотных последовательностей. Оказалось, что во всех бактериальных и эукариотических геномах для кодирования аминокислот исполь­зуются одни и те же наборы триплетов нуклеотидов.

Однако недавно в митохондриях некоторых видов были об­наружены первые исключения. В митохондриальной ДНК ко­дон УГА читается так же, как УГГ и, следовательно, является не кодоном-терминатором, а кодоном для триптофана. Это справедливо для всех митохондриальных геномов. У некоторых видов обнаружены специфические изменения кода. У дрожжей кодон ЦУА кодирует трионин вместо лейцина. У млекопитаю­щих АУА имеет то же значение, что и АУГ, и означает метио­нин вместо изолейцина. Кодоны АГА и АГЦ не кодируют арги­нина, а являются терминаторами.

 

133

 

	С
Leu	T
	G G	Тгр
Asp	A
	С T	Thr
Phe	T
	T G T	Leu
Val	T
	G G	Тгр
Gly	G
	A T	Asp
Туг	A
	С	Тгр
	С
Pro	C
	T	Leu
	C G
Arg	G
	С	Ala
	T
Phe	T
	T C	Phe

Универсальность кода (за редким ис­ключением) свидетельствует о его раннем происхождении в эволюции. Возможно, на ранних этапах только первые два основа­ния служили для узнавания, а роль третье­го основания определилась позднее. В не­который момент код был «заморожен» в его современном виде. Всякая мутация, из­меняющая код, изменит последователь­ность аминокислот у большинства белков. Многие из этих изменений могут быть ле­тальными. Следовательно, должно сущест­вовать сильное давление отбора против та­ких мутаций.

Рамки считывания могут перекрывать­ ся. Концепция генетического кода предпо­лагает, что аминокислотная последователь­ность записана в одной из трех рамок счи­тывания на данном отрезке молекулы ДНК. Эта рамка называется открытой. На­чалом кодирующей области является стар­товый кодон, а завершается она одним из кодонов-терминаторов. Две другие рамки считывания называются блокированными. Они не используются для синтеза белка, поскольку содержат много кодонов-терми­наторов. Поэтому у мутантов со сдвигом рамки считывания синтез полипептидной цепи быстро прекращается.

Первым исключением из правила была ДНК бактериофага ФХ 174, которая содер-жит 5375 нуклеотидов и кодирует более2000аминокислот. Расшифровка нуклео-

Рис. 2.12. Перекрываю- щиеся гены в ДНК фага 174. В двух рамках считывания закодированы две последова­тельности аминокислот

тидной последовательности фаговой ДНК позволила разрешить эту парадоксальную ситуацию. Были обнаружены две перекры-

вающиеся рамки считывания, т. е. в одной и той же последова­тельности нуклеотидов достаточно протяженной длины (около 300 нуклеотидов) закодированы две различные аминокислотные последовательности. Таким образом различные белки могут ко­дироваться альтернативными рамками считывания, они могут начинаться и кончаться в разных местах и участок перекрытия может варьировать в широких пределах (рис. 2.12). У бактерио­фага G4 обнаружены короткие участки генома, которые коди-

 

134

 

руют части трех различных белков во всех трех рамках считы­вания.

Двойная спираль ДНК содержит шесть рамок считывания (по три в каждой цепи). Как правило, в любой данной точке только одна цепь является кодирующей. Сейчас обнаружены случаи перекрывания рамок считывания в комплементарных цепях ДНК.

Присутствие перекрывающихся рамок считывания увеличи­вает генетическую емкость генома. Это особенно важно для ви­русов, размер генома которых ограничен размером белковой оболочки. При этом, однако, кодирующая гибкость ДНК строго ограничивается, так как мутации в перекрывающихся областях могут приводить к аминокислотным заменам сразу в одном или двух белках.

 

 

ТРАНСКРИПЦИЯ

 

Общие положения. В этой и последующей главах будут рассмотрены процессы, обеспечивающие выражение в феноти­пе (экспрессию) генетической информации, содержащейся в ДНК. В генах закодирована информация о белках, синтези­руемых в клетке. Однако сама ДНК не используется в качест­ве непосредственной матрицы для синтеза белка. Реализация генетической информации представляет собой двустадийный процесс. На первой стадии ген служит матрицей для синтеза молекул РНК, на которые совершенно точно транскрибирует­ся (переписывается) последовательность нуклеотидов соответ­ствующего гена и, следовательно, закодированная в нем ин­формация о последовательности аминокислот. На второй ста­дии нуклеотидная последовательность РНК транслируется (переводится) в полипептидную цепь. Таким образом, поток генетической информации в клетке идет в следующем направ­лении: ДНК → транскрипция →РНК → трансляция → белок.

Клетки содержат три типа РНК: 1) информационная РНК (ее называют также матричная, отсюда мРНК) служит матри­цей для синтеза белка. Каждому работающему гену (или груп­пе генов) соответствует своя молекула мРНК- Следовательно, мРНК — крайне гетерогенный по размерам и нуклеотидной по­следовательности класс молекул. У Е. coliсредняя длина моле­кулы РНК составляет примерно 1,2 кб; 2) транспортная РНК (тРНК) переносит аминокислоты в активированной форме к ри­босомам, где происходит синтез белковой молекулы (см. разд. 2.8); 3) рибосомная РНК (рРНК)— необходимый компонент ри­босом. Существует несколько разновидностей рРНК (у прока-

 

 

135

 

риот — 3, у эукариот— 5). В каждой рибосоме содержится по одной молекуле каждого типа. На долю рРНК, в клетке Е. coliприходится 80%, количество тРНК составляет 15%, и меньше всего в клетке мРНК, на долю которой приходится всего лишь 5% всей РНК.

В основе механизма копирования при транскрипции лежит тот же структурный принцип комплементарного спаривания оснований, что и при репликации. Транскрипция осуществляет­ся ферментами РНК-полимеразами, синтезирующими РНК на ДНК-матрице. В качестве предшественников используются рибонуклеозидтрифосфаты (рис. 2.13).

Транскрипция начинается после присоединения РНК-полимеразы к специфической нуклеотидной последовательности ДНҚ, к так называемому промотору. Завершается транскрип­ция при достижении РНК-полимеразы стоп-сигнала, или сигна­ла терминации транскрипции. Участок ДНК, ограниченный

 

промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции — транскриптон.

В принципе обе комплементарные цепи ДНК могут служить матрицами для синтеза РНК. В действительности в пределах транскриптона копируется только одна из нитей ДНК, которая называется матричной, или значащей. В разных транскриптонах значащими могут быть разные цепи ДНК. Выбор транс­крибируемой цепи определяется ориентацией промотора. Со­седние транскриптоны могут быть отделены друг от друга нетранскрибируемыми участками ДНК, а могут и перекрываться, в частности так, что в пределах участка пере­крывания матричными оказываются обе нити.

Разбиение ДНК на множество транскриптонов обеспечива­ет возможность независимого считывания разных генов, их ин­дивидуального включения и выключения. У эукариот в состав транскриптонов входит, как правило, только один ген. Транс­криптоны прокариот чаще называют оперонами: многие из них обычно содержат по нескольку генов, обычно функционально связанных. Существуют опероны, содержащие гены, не коди­рующие белков (гены рРНК, тРНК и др.). Описаны смешанные опероны, включающие гены тРНК и белков.

РНК-полимераза — основной фермент, участвующий в транскрипции. Лучше всего этот фермент изучен у прокариот, у которых весь синтез РНК осуществляется одним-единственным ферментом этого типа (см. рис. 2.13). У бактерий молекула РНК-полимеразы состоит из двух компонентов: минимальной РНК-полимеразы, или «кор»-фермента (от англ. core — сердце­вина), содержащего все каталитические центры, участвующие в синтезе РНК; σ-субъединицы, необходимой для правильного присоединения к промотору и отделяющейся от РНК-полимера­зы после начала синтеза РНК- Минимальная РНК-полимераза состоит из четырех субъединиц: двух идентичных α-субъединиц и неидентичных β- и β'-субъединиц. Установлено, что α-субъединица участвует в связывании фермента с ДНК матрицей, а — β-субъединица — в связывании субстратов — рибонуклеозидтрифосфатов. Функция α-субъединицы не известна.

Транскрипция эукариотической ДНК в принципе не отлича­ется от таковой у прокариот, но РНК-синтезирующий аппарат эукариотической клетки устроен гораздо сложнее. Он включает три различные РНК-полимеразы, каждая из которых считыва­ет определенный тип генов и имеет гораздо более сложное строение, чем бактериальный фермент: в состав эукариотических РНК-полимераз входит от 9 до 11 полипептидных цепей.

 

 

137

Только одна из трех эукариотических РНК-полимераз, а имен­но РНҚ-полимераза II, транскрибирует гены, которые затем будут транслированы в белки. Две другие полимеразы катали­зируют образование различных типов РНК, которые составля­ют часть белок-синтезирующего аппарата: РНК-полимераза I синтезирует высокомолекулярную рибосомную РНК, а РНК-по­лимераза III — разнообразные низкомолекулярные стабильные РНК, в том числе тРНК и рибосомную 5S-PHK. Специфиче­ским ингибитором РНК-полимеразы II является — аматин — высокотоксичное вещество, получаемое из бледной по­ганки. Вполне естественно, что эти три фермента узнают на ДНК различные сигнальные участки, в частности последова­тельности, инициирующие синтез РНК.

Клетки высших эукариот содержат около 40 000 молекул РНК-полимеразы II, примерно такое же число молекул РНК-полимеразы I и около 20 000 молекул РНК-полимеразы III, причем точное число этих ферментов варьирует в зависимо­сти от скорости роста клеток.

Особые РНК-полимеразы обеспечивают транскрипцию ДНК клеточных органелл эукариот — хлоропластов и митохон­дрий. РНК-полимераза хлоропластов имеет сходство с бактери­альным ферментом. РНК-полимеразы митохондрий состоят, повидимому, всего из одной субъединицы и сходны по амино­кислотной последовательности с РНК-полимеразами некоторых бактериофагов. Ген, кодирующий митохондриальную РНК-полимеразу, располагается в ядре.

Цикл транскрипции можно разделить на четыре основных стадии, каждая из которых включает множество элементарных событий: 1) связывание с ДНК; 2) инициация цепи РНК; 3) рост (элонгация) цепи РНК; 4) терминация цепи РНК (см. рис. 2.13).

Этот цикл у бактерий осуществим в простой бесклеточной системе, состоящей из ДНК-матрицы и очищенной РНК-поли­меразы, без каких бы то ни было вспомогательных факторов. В клетке в транскрипции участвуют разнообразные регуляторные белки, выполняющие вспомогательные функции, и изучение транскрипции в бесклеточной системе позволяет понять не только ферментативные механизмы синтеза РНК, но и дает ключ к пониманию механизмов транскрипции.

У эукариот транскрипция изучена хуже, и это, в частности, связано с тем, что эукариотические РНК-полимеразы не спо­собны осуществить полный цикл транскрипции в бесклеточной системе. Однако в основных чертах цикл транскрипции у эука­риот и бактерий сходен.

 

138

Цикл транскрипции начинается с присоединения РНК-поли­меразы к промотору — строго определенному участку ДНК, оп­ределяющему место начала синтеза РНК- Оказавшись на про­моторе, РНК-полимераза образует с ним так называемый за­крытый промоторный комплекс, в котором ДНК сохраняет двуспиральную структуру. В закрытом комплексе РНК-поли­мераза не может начать транскрипцию, кроме того, он нестаби­лен и легко диссоциирует при повышении ионной силы.

Закрытый комплекс может обратимо превращаться в от­крытый. При этом РНК-полимераза расплетает примерно один виток двойной спирали ДНК в районе стартовой точки — нуклеотида, с которого начнется комплементарное копирование матрицы. В открытом комплексе связь РНК-полимеразы с ДНК существенно упрочняется.

Следующая стадия, инициация, осуществляется при наличии субстратов РНК-полимеразы, нуклеозидтрифосфатов и состоит в образовании первых нескольких звеньев цепи РНК. Первый нук-леотид входит в состав цепи, сохраняя свою трифосфатную груп­пу, а последующие присоединяются к З'-ОН-группе предыдуще­го с освобождением пирофосфата. Таким образом, рост цепи РНК идет в направлении 5'→3', как при синтезе ДНК, а РНК-полимераза движется по матричной цепи в направлении 3'→5'. На стадии инициации продукт связан с матрицей и с РНК-полимеразой непрочно и с высокой вероятностью может высвобождаться из комплекса. В этом случае РНК-полимераза, не покидая промотора, снова инициирует РНК- Когда РНК-про­дукт достигает длины 3—9 нуклеотидов (в зависимости от про­мотора), транскрибирующий комплекс стабилизируется и уже не распадается до тех пор, пока синтез молекулы РНК не завер­шится. Примерно в этот момент σ-субъединица отделяется от фермента и начинается стадия элонгации.

Эффективность инициации на разных промоторах, их «си­ла», существенно различается: с некоторых промоторов за пе­риод деления клетки может инициироваться всего одна-две мо­лекулы РНК, тогда как в других инициациях может происхо­дить каждые одну-две секунды. Сила большинства промоторов увеличивается с ростом степени отрицательной сверхспирализации ДНК, поскольку при этом облегчается расплетение ДНК и, как следствие, переход из закрытого в открытый промотор­ный комплекс.

На стадии элонгации в ДНК расплетено около 18 н. п. При­мерно 12 нуклеотидов матричной нити ДНК образует гибрид­ную спираль с растущим концом цепи РНК. По мере движения

 

139

РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расплетение, а позади — восстановление двойной спирали ДНК. Одновре­менно происходит освобождение синтезированной РНК из ком­плекса с матрицей и с РНК-полимеразой. Эти перемещения должны сопровождаться относительным вращением РНК-полиме­разы и ДНК, и не исключено, что в транскрипционный комплекс входят топоизомеразы, предотвращающие такое вращение.

Максимальная скорость элонгации составляет примерно 50 нуклеотидов в секунду. Особенно хорошо это видно при низких концентрациях субстратов. В некоторых случаях даже при оп­тимальных концентрациях субстратов на определенных участ­ках матрицы происходят длительные задержки в продвижении РНК-полимеразы, так называемые паузы.

В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза не облада­ет способностью к самокоррекции. В связи с этим надежность транскрипции гораздо ниже, чем надежность репликации. Час­тота ошибок при синтезе РНК составляет примерно одну ошиб­ку на 10' нуклеотидов. Гораздо более низкую надежность син­теза РНК клетка обходит тем, что с одного гена синтезируется много копий РНК-транскриптов.

Терминация транскрипции регулируется так же тонко, как и инициация. В отсутствие специальных белковых факторов терминации РНК-полимераза способна терминировать синтез РНК на тех терминаторах, нуклеотидная последовательность в районе которых отличаются двумя характерными особенностя­ми. В них по ходу транскрипции сначала идет участок, обога­щенный ГЦ-назами и обладающий центральной симметрией, а затем участок из 4—8 расположенных подряд А в значащей це­пи. Транскрипция заканчивается в конце олигоА последова­тельности или сразу за ней. Предполагается, что после прохож­дения РНК-полимеразой участка с центральной симметрией, обогащенного ГЦ, в РНК-продукте возникает «шпилька», при­водящая к остановке фермента и разрушению части РНК — ДНК гибрида транскрибирующего комплекса. Остав­шаяся часть РНК. — ДНК гибрида легко плавится в виду не­стабильности рУ * рА пар, что приводит к освобождению РНК-продукта. Многие терминаторы узнаются РНК-полимера­зой только с помощью фактора терминации, названного β. Кон­кретный механизм вытеснения РНК из транскрипционного ком­плекса под действием β-фактора пока не выяснен.

Процессинг первичных транскриптов. Молекулы предшест­венников зрелых клеточных РНК подвергаются расщеплению и химической модификации. Совокупность биохимических реак-

140

ций, в результате которых уменьшается молекулярная масса РНК-предшественника и осуществляются разные способы хи­мической модификации с образованием зрелых молекул РНК, называют процессингом. Процессинг наблюдается в прокарио-тических клетках, но особенно сложны превращения предше­ственников клеточных РНК в ядрах эукариот. В клетках эукариот только незначительная часть, около 10% транскрибируе­мых в ядре последовательностей ДНК выявляются в составе цитоплазматических мРНК. Основная часть новообразованной РНК распадается в ядре и не обнаруживается в цитоплазме.

Процессингу прокариот. Молекулы мРНК у прокариот практически не подвергаются процессингу. У неко­торых бактерий транскрипция и трансляция сопряжены, т. е. происходят одновременно. 5'-конец мРНК может транслиро­ваться на рибосоме и затем подвергаться деградации еще до завершения  ее синтеза на З'-конце (рис. 2.14).

Молекулы прокариотических транспортных рабосомных РНК образуются путем расщепления и химической модифика­ции новосинтезированных цепей РНК- Например, у Е. coliтри вида молекул рибосомной РНК и одна молекула тРНК входят в состав первичного транскрипта. Другие транскрипты кроме молекул рРНК содержат по нескольку различных видов тРНК или несколько копий одной и той же тРНК. Кроме того, транс­крипты содержат разграничивающие (спейсерные) последова­тельности, различные по длине и нуклеотидному составу. Эти транскрипты подвергаются атаке нуклеаз, действующих с ис­ключительно высокой точностью. Нуклеазы расщепляют и уко­рачивают предшественники тРНК и рРНК. Например, нуклеаза Р образует правильные 5'-концы всех молекул тРНК в клет­ке Е. coli . Рибонуклеаза III вырезает в предшественнике 5S-, 16S- и 23S-pPHK из первичного транскрипта, расщепляя РНК в двуспиральных шпилечных областях.

Если З'-конец тРНК не несет концевой последовательности ЦЦА, то эти основания присоединяются по постсинтетической модификации. Необычные основания, которые встречаются во всех молекулах тРНК, образуются путем ферментативной мо­дификации обычных рибонуклеотидов, входящих в состав пред­шественника тРНК.

Процессинг у эукариот. Процессинг тРНК у эука­риот протекает примерно по такому же механизму, как и у про­кариот. Функционально активные молекулы образуются из более длинного предшественника, который подвергается расщеплению и модификации с включением минорных оснований (см. рис. 2.14).

141

 

Процессинг рРНК также аналогичен соответствующему процессу у прокариот. Первичный транскрипт содержит участ­ки, отвечающие 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK, разделенные спенсера­ми. Как и у прокариот, эти три рРНК, образуются при расщеп­лении спейсерных последовательностей.

При изучении генов эукариот выяснилось, что они имеют мозаичную структуру. В таких «разорванных» генах кодирую­щие области — экзоны — чередуются с некодирующими — ни­тронами. Число интронов может сильно варьировать: от одного в гене актина дрожжей до нескольких десятков (17 в ге-

142

не — кристаллина птиц и 50 в гене проколлагена млекопитаю­щих). Интроны могут составлять большую часть мозаичного ге­на. Суммарная нуклеотидная длина интронов во много раз мо­жет превышать длину экзонов. Экзонами называют районы ге­на, которые кодируют участки полипептидной цепи, также называют и районы транскриптов, входящих в состав зрелых мРНК, но не транслируются (например, лидерная область пе­ред инициирующим  кодоном).

Инициация транскрипции эукариотических генов сопровож­дается модификацией 5'-конца РНК с образованием специфи­ческой нуклеотидной структуры, в которой 7-метилированный остаток гуанозин-5'-трифосфата соединен 5'—5'-фосфодиэфирной связью с концевым нуклеотидом РНК- Это так называемый кэп (от англ. cap), который присоединяется сразу после ини­циации транскрипции к А или Г. Модифицированный 5'-конец обеспечивает эффективную трансляцию мРНК и удлиняет вре­мя ее жизни в клетке. Образование кэпа также способствует дальнейшему ходу процессинга.

Транскрипция экзонов и интронов сложного эукариотиче-ского гена осуществляется в порядке их расположения друг за другом (коллинеарная транскрипция), после чего вырезаются районы интронов, а экзоны сшиваются в результате процесса, называемого сплайсингом.

ТРАНСЛЯЦИЯ

Основные этапы. Трансляция — это процесс декодирования мРНК, в результате которого информация с языка последова­тельности оснований мРНК переводится на язык аминокислот­ной последовательности белка. Трансляция — процесс, хотя и матричный, но более сложный, чем репликация или транскрип­ция, которые происходят с использованием одного и того же языка спаривания оснований. В этом процессе согласованно взаимодействует более сотни видов макромолекул. Помимо ри­босом необходимы молекулы тРНК, активирующие ферменты, растворимые факторы и мРНК.

Синтез белка осуществляется путем последовательной по­ликонденсации отдельных аминокислотных остатков, начиная с амино-(N)-конца полипептидной цепи в направлении к кар­боксильному (С)-концу. Декодирование мРНК происходит со­ответственно в направлении 5'→3'. Транскрипции предшест­вует активация тРНК — присоединение аминокислоты к З'-концевому аденозину молекулы тРНК с образованием аминоацил-тРНК. Синтез белка осуществляется в три стадии: 1)

 

 

143

 

инициация, приводящая к связыванию инициаторной тРНК с сигналом начала трансляции в мРНК, при этом инициаторная тРНК занимает Р-участок рибосомы, один из двух участков связывания тРНК; 2) элонгация начинается со связывания аминоацил-тРНК с другим участком связывания на рибосоме (А-участком) с последующим образованием пептидной связи между аминогруппой второй аминоацил-тРНК и карбоксиль­ной группой ф-метионина, связанного с инициаторной тРНК; образовавшаяся дипептидил-тРНК перемещается из А-участка в Р-участок, новая аминокислота связывается с освободив­шимся А-участком, и начинается новый цикл реакции элонга­ции; 3) терминация происходит тогда, когда стоп-кодон (сиг­нал терминации) в молекуле тРНК считывается фактором освобождения белка, что приводит к отделению завершенной полипептидной цепи от рибосомы. Ниже процесс трансляции будет описан более подробно на примере синтеза белка в клетках Е. coli , где он лучше всего изучен.

Активация тРНК. Каким образом молекула тРНК узнает «свою» аминокислоту? Существует специальный набор фермен­тов, так называемых аминоацил-тРНК-синтетаз, которые при­соединяют аминокислоты к соответствующим молекулам тРНК-Для каждой из аминокислот имеется своя особая синтетаза: она присоединяет глицин к глициновой тРНК, валин — к валиновой и т. д. Реакция присоединения протекает в два этапа и приводит к образованию аминоацил-тРНК (рис. 2.15). Сначала аминокислота активируется путем связывания ее карбоксиль­ной группы непосредственно с АМФ, т. е. образуется аденилированная аминокислота; источником энергии для реакции аденилирования, в обычных условиях невыгодной в термодинами­ческом смысле, служит гидролиз АТФ. Оставаясь связанной с аминоацил-тРНК-синтетазой, аденилированная карбоксильная группа аминокислоты переносится затем на гидроксильную группу остатка сахара, находящуюся на З'-конце молекулы тРНК. В результате аминокислота оказывается присоединен­ной к тРНК сложноэфирной связью.

Таким образом аминоацид-тРНК-синтетаза выполняет адапторную роль, осуществляя высокоспецифичную подгонку одной молекулярной поверхности к другой.

Структура тРНК. Молекулы тРНК играют роль конечных адапторов при переводе информации, заключенной в нуклеотидной последовательности, на язык белка. Таким образом, ге­нетический код расшифровывается при помощи двух взаимо­связанных наборов адапторов.

Молекулы тРНК обладают многими общими структурными особенностями. Это вполне естественно, поскольку все молеку-

 

 

144

 

лы тРНК должны взаимодействовать примерно одинаковым об­разом с рибосомами и мРНК (должны укладываться в А- и Р-участки рибосомы и взаимодействовать с ферментом, катали­зирующим образование пептидной связи).

Все молекулы транспортных РНК обладают следующими общими свойствами (рис. 2.16).

1. Состоят из одной цепи длиной от 73 до 93 рибонуклеотидов.

2. Содержат много необычных оснований, как правило, от 7 до 15 на молекулу. Многие из этих оснований представляют со­бой метилированные или диметилированные производные А, У, Ц и Г, которые образуются путем ферментативной модифика­ции тРНК-предшественника.

3. 5'-конец тРНК фосфорилирован. На 5'-конце обычно рас­положен остаток — гуанин.

4. На З'-конце всех тРНК находится последовательность ЦЦА. Активированная аминогруппа прикрепляется к З'-гидроксильной группе концевого аденозина.

145

 

5. Примерно половина нуклеотидов тРНК спарена и обра­зует участки двойной спирали. Не спарены пять групп основа­ний.

6. Антикодоновая петля состоит из семи оснований, располо­женных в следующей последовательности:

 

Пиримидин —Пиримидин —X — Y — Z — Модифициро- —Вариабель-

˅     ванный пурин ное основание

антикодоновое основание

146

 

В результате рентгеновских кристаллографических исследо­ваний установлена трехмерная структура молекулы тРНК. Она имеет L-образную форму и содержит два участка двойной спи­рали примерно по десять пар оснований в каждом. Спираль­ные участки расположены перпендикулярно друг другу, что и придает молекуле L-образную форму. ЦЦА-участок прикрепле­ния аминокислоты расположен на одном из концов L. Другой конец L содержит антикодоновую петлю, и таким образом, аминокислота, связанная с тРНК, удалена от антикодона на расстоянии примерно 80А.

Кодон-антикодоновое взаимодействие. В каком месте будет присоединена к растущей полипептидной цепи данная аминокис­лота, зависит не от самой аминокислоты, а от присоединившей ее молекулы тРНК: Выяснить это удалось при помощи изящного эксперимента, в котором аминокислоту, присоединенную к специ-. фической тРНК, химическим путем превращали в другую амино­кислоту (цистеин в аланин). Когда такие гибридные молекулы участвовали в синтезе белка в бесклеточной системе, «неправиль-

 

147

ная» аминокислота включалась в белковую цепь во всех тех поло­жениях, где должна была быть «правильная» аминокислота. Ус­пешное декодирование зависит, следовательно, от точности меха­низма, который в норме обеспечивает связь между каждой активированной аминокислотой и соответствующей молекулой тРНК, и от точности кодон-антикодонового взаимодействия.

Но генетический код вырожден (большей части аминокислот соответствует более одного кодона). Эту вырожденность можно истолковать двояко: 1) одна молекула тРНК может взаимодей­ствовать более, чем с одним кодоном; 2) для каждой аминокис­лоты имеется более одной тРНК. В действительности справед­ливо и то и другое. Для некоторых аминокислот существует бо­лее одной тРНК. Кроме того, некоторые тРНК таковы, что требуют точного спаривания только по первым двум положени­ям кодона; в третьем положении допускается и неверное спари­вание (так называемое неоднозначное соответствие), т. е. на спаривание третьего основания накладываются менее строгие стерические ограничения, чем на спаривание двух других.

С третьим нуклеотидом кодона взаимодействует первый нук-леотид антикодона (порядок нуклеотидов считается от 5'- к З'-концу). Часто первое положение в антикодоне тРНК занято необыч­ным основанием инозином (I), которое может образовывать водо­родные связи с У, Ц или А, находящимися в кодоне в третьем положении. Кроме того, У в первом положении может взаимодей­ствовать с А или Г, а А — с Ц или У. Таким образом в связи с механизмом «качания» клетке требуется меньше 64 различных тРНК- Каждая тРНК может узнавать до трех кодонов.

Структура рибосом. Все этапы белкового синтеза оказыва­ются возможными вследствие того, что трансляция осуществля­ется крупным мультиферментным комплексом — рибосомой, состоящей из молекул белков и РНК. В течение всего процесса синтеза белка растущая полипептидная цепь, мРНК и очеред­ная аминоацил-тРНК остаются прикрепленными к рибосоме.

Рибосомы эукариот и прокариот очень сходны по своей структуре и функции. Каждая из них состоит из двух субчас­тиц— большой и малой. В эукариотических рибосомах прибли­зительно половину массы составляет РНК; малая субчастица состоит из одной молекулы рибосомной РНК (рРНК), связант ной приблизительно с 33 различными рибосомными белками, а в большой субчастице свыше 40 различных рибосомных белков связано с тремя различными молекулами рРНК. Прокариоти-ческие рибосомы несколько мельче и содержат меньшее число компонентов. В рибосомах обоих типов имеется бороздка, удер­живающая растущую полипептидную цепь, и бороздка, удер-

148

живающая молекулу мРНК- Длина бороздок такова, что в пер­вой из них умещается примерно 30 аминокислот, а во второй — около 35 нуклеотидов РНК.

В рибосоме имеется два участка, связывающих молекулы тРНК. Один из них удерживает молекулу тРНК, присоединен­ную к растущему концу полипептидной цепи; поэтому его на­зывают пептидил-тРНК-связывающим участком, или Р-участ-ком. Второй служит для удержания только что прибывшей мо­лекулы тРНК, нагруженной аминокислотой; его называют аминоаци-тРНК-связывающим участком, или А-участком. К обоим участкам молекула тРНК прикрепляется лишь в том случае, если ее антикодон спаривается с комплементарным ему кодоном мРНК. А- и Р-участки располагаются очень близко друг к другу, так что две связанные с ними молекулы тРНК спариваются с двумя соседними кодонами в молекуле мРНК.

Удалось осуществить invitro самосборку целой функцио­нальной рибосомы из составляющих ее белков. Это говорит о том, что сложная структура рибосомы обусловлена исключи­тельно взаимодействиями входящих в ее состав молекул.

Направление синтеза белка. Основная реакция в синтезе белка—это реакция, приводящая к образованию пептидной связи между карбоксильной группой на конце растущей поли­пептидной цепи и свободной аминогруппой аминокислоты. Сле­довательно, белковая цепь синтезируется путем ее постепенно­го наращивания от аминного конца к карбоксильному. На про­тяжении всего процесса растущий карбоксильный конец полипептидной цепи остается в активированном состоянии, бу­дучи связан ковалентной связью с тРНК. Эта энергия расходу­ется на образование пептидной связи. Таким образом, в про­цессе синтеза белка каждая добавляемая аминокислота несет с собой энергию активации, необходимую не для ее собственного присоединения, а для присоединения следующей аминокисло­ты. Такой рост называется «ростом с головы». В этом смысле трансляция отличается от репликации и транскрипции, где рост полимерной цепи идет «с хвоста».

Информационная РНК транслируется в направлении 5'→3'. Поскольку синтез РНК идет в том же направлении, то мРНК (прокариотическая) может транслироваться уже в то время, когда она синтезируется. Действительному Е. соіі 5'-конец мРНК взаимодействует с рибосомами вскоре после того, как он синтезировался, и трансляция оказывается тесно свя­занной с транскрипцией во времени и пространстве. У эукари­от эти процессы разобщены.

 

149

 

Одну молекулу мРНК могут транслировать несколько рибо­сом. Это существенно увеличивает эффективность использова­ния мРНК. Группа рибосом, связанных с одной молекулой мРНК, называется полирибосомой, или полисомой. Рибосомы, входящие в состав этой структуры, работают независимо. При максимальной плотности рибосом на мРНК одна рибосома приходится на 80 нуклеотидов.

Инициация трансляции. Трансляция начинается со сборки инициаторного комплекса в том самом месте на мРНК, с кото­рого должен начаться синтез полипептидной цепи (рис. 2.17). Сборка комплекса состоит из ряда этапов, катализируемых белками — факторами инициации.

На 5'-конце молекулы мРНК находится участок инициации, включающий инициирующий кодон АУГ (или ГУГ) и богатую пуринами последовательность, центр которой находится на рас­стоянии примерно 10 нуклеотидов в 5'-сторону от инициирую­щего кодона. Эта последовательность комплементарна З'-конце-вой последовательности молекулы 16S рРНК, входящей в со­став малой субъединицы рибосомы. Последовательности взаимодействуют с образованием дуплексов длиной 3—9 н. п., и малая субъединица рибосомы оказывается в комплексе с мРНК.

Еще до того, как эта малая субчастица присоединится к мРНК, она нагружается особой инициаторной тРНК (тРНКf), уз­нающей кодон АУГ и несущей модифицированный метионин — формилметионин (fMeT). Таким образом, синтез белка у бактерий начинается с формилметионина.

МРНК, рибосомная 30S-субчастица и fтРНК образуют 30S-комплекс инициации, в котором антикодон tPHKJсоединен со старт-кодоном. Таким образом, рамка считывания устанав­ливается специфическим взаимодействием рибосомы и fMet — TPHKf с мРНК. Для образования этого комплекса необходимы ГТФ и три белковых фактора IF-1,IF-2 и IF-3.

Затем бОБ-субчастица рибосомы присоединяется к инициа-торному ЗОБ-комплексу, образуя инициаторный 708-комплекс. На этом этапе происходит гидролиз связанного ГТФ. 70S-hhh-циаторный комплекс готов к стадии элонгации белкового синте­за. Молекула fMet — TPHKf занимает Р-участок рибосомы. А-участок еще пуст.

Элонгация трансляции. Процесс элонгации (наращивания) полипептидной цепи на рибосоме может рассматриваться как цикл, слагающийся из трех отдельных этапов (см. рис. 2.17).

Iэтап. Молекула аминоацил-тРНК связывается со сво­бодным А-участком рибосомы, примыкающим к занятому

 

150

 

Р-участку; связывание осуществляется за счет спаривания нук­леотидов антикодона с тремя нуклеотидами мРНК, находящи­мися в А-участке. Комплементарная аминоацил-тРНК достав­ляется в А-участок белком, который называется фактором элонгации EF-Tu. Важно отметить, что TF—Тu не взаимодейст-

151

вует с fMet — TPHKf. Поэтому инициаторная тРНК не попада­ет в А-участок. В то же время обычный метионин, связанный с тРНКм (Met — тРНКм), связывается с EF—Тu подобно всем другим аминоацил-тРНК. Этим и объясняется тот факт, что внутренние кодоны АУГ не считываются инициаторной мРНК.

II этап. Карбоксильный конец полипептидной цепи отде­ляется в Р-участке от молекулы тРНК. и образует пептидную связь с аминокислотой, присоединенной к молекуле тРНК в А-участке. Эта реакция катализируется пептидилтрансферазой — ферментом, прочно связанным с рибосомой. После обра­зования пептидной связи ненагруженная тРНК занимает Р-участок, а дипептидил-тРНК занимает А-участок.

III       этап — процесс транслокации: ненагруженная тРНК покидает Р-участок, пептидил-тРНК переходит из А-участка в Р-участок и мРНК продвигается на три нуклеотида. В результате следующий кодон занимает нужное положение для считывания очередной мРНК. Для транслокации необходим третий фактор элонгации — EF—G.

После завершения III этапа незанятый А-участок может принять новую молекулу тРНК, нагруженную аминокислотой, т. е. цикл может начаться снова. В бактериальной клетке про­должительность одного цикла элонгации полипептидной цепи составляет при оптимальных условиях около 0,05 с, так что синтез среднего по размерам белка, состоящего из 400 амино­кислот, занимает приблизительно 20 с.

Для большинства клеток синтез белка — наиболее энерго­емкий из всех синтетических процессов. Для образования каж­дой новой связи требуется энергия, высвобождающаяся при расщеплении четырех высокоэнергетических фосфатных связей. Две из них расходуются на то, чтобы нагрузить аминокислотой молекулу тРНҚ, а две — на сам сиятез: при связывании ами-ноацил-тРНК на I этапе цикла и при транслокации рибосомы.

Терминация. Если А-участок рибосомы занят одним из стоп-кодонов, УАА, УГА или УАГ, то связывание аминоа-цил-тРНҚ обычно не происходит. Нормальные клетки не содер­жат тРНК с антикодонами, комплементарными сигналам тер-минации. Последние распознаются белковыми факторами осво­бождения, что свидетельствует о том, что белки способны узнавать тринуклеотидные последовательности с высокой сте­пенью точности.

Связывание фактора освобождения изменяет активность пептидилтрансферазы. Фермент с такой измененной активно­стью присоединяет теперь к пептидил-тРНК не свободную ами­ногруппу аминокислоты, а молекулу воды. Вследствие этого

 

 

152
карбоксильный конец растущей полипептидной цепи отделяет­ся от молекулы тРНК. А поскольку растущий полипептид удер­живается на рибосоме только посредством его связи с молеку­лой тРНК, завершенная белковая цепь оказывается свободной и, отделившись от рибосомы, поступает в цитоплазму.

Посттрансляционная модификация. Многие полипептиды по окончании трансляции претерпевают ряд различных моди­фикаций. 1. Формильная группа на N-конце бактериальных белков гидролизуется деформилазой. Под действием аминопеп-тидазы может произойти отщепление одного или нескольких концевых остатков. Концевой метионин иногда отщепляется до завершения синтеза полипептидной цепи. 2. При окислении двух цистеиновых остатков могут образоваться дисульфидные связи. 3. Боковые цепи некоторых белков могут быть специфи­чески модифицированы. Остатки пролина и лизина гидроксилируются. В результате присоединения Сахаров к боковым цепям аспарагина, серина и треонина образуются гликопротеины. Не­которые белки фосфорилируются. К ферментам ковалентно присоединяются простетические группы, например, липоевая кислота. 4. Полипептидные цепи могут подвергаться специфи­ческому расщеплению.

ГЛАВА 3

---

Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 293; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!