ГОРМОНОНЕЗАВИСИМЫЕ РАСТИТЕЛЬНЫЕ ТКАНИ

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 33Следующая ⇒

Каллусные клетки могут делиться только при наличии гор-монов в питательной среде. Однако при длительном культиви-ровании они в ряде случаев могут приобрести способность рас-ти на среде без гормонов, т.е. становятся автономными по отно-шению к ауксинам и цитокининам. Такие клетки называются «привыкшими». Нередко ткани, образованные «привыкшими» клетками, называют химическими опухолями. «Привыкшие» ткани, как и опухолевые, в большинстве случаев не способны к нормальной регенерации и образуют лишь тератомы, хотя по некоторым данным из них в отдельных случаях получаются нормальные регенеранты.

Следует отметить, что у всех каллусных тканей в процессе культивирования, у некоторых культур уже начиная с 4-го пас-сажа, заметно снижается, а затем и полностью утрачивается способность к регенерации. Из старых пересадочных культур получить растения-регенеранты не удается.

Пока нет четкого ответа о причинах «привыкания». Возмож-но, что оно связано с длительным действием на клетки гормо-нов, поддерживающих их в дедифференцированном или актив-но пролиферирующем состоянии.

Кроме «привыкших» тканей, представляющих собой химиче-ские опухоли, существуют опухоли растительного происхожде-ния, вызванные бактериями, вирусами, а также генетические опухоли, возникающие на межвидовых гибридах различных растений. Наиболее распространенными в природе и представ-ляющими наибольший интерес для исследователей являются корончатые галлы-опухоли, индуцированные у двудольных рас-тений агробактериями ( Agrobacteriumtumefaciens ). Часто встречаются еще два вида истинных опухолей у растений — бо-родатый корень (заболевание, вызываемое А. rhizoden . es ) и стеблевой галл, вызываемый A . rubi , сходный с корончатым галлом.

Общим свойством «привыкших» и опухолевых растительных тканей является их гормононезависимость, т.е. способность рас-ти на средах без гормонов. Это основное их отличие от каллус-ных тканей, для которых присутствие гормонов в питательной

среде является необходимым условием дедифференцировки и пролиферации клеток.

В «привыкших» тканях, так же как и в опухолевых, идет интенсивный синтез собственных гормонов, поэтому они не нуждаются во внесении их в питательные среды.

Внешне гормононезависимые ткани не отличаются от каллусных, и основным их отличием является приобретение способности к интенсивному синтезу гормонов. Это свойство является общим как для «привыкших», так и для опухолевых клеток. Однако пути для решения этой задачи у них различны. У «привыкших» тканей гормононезависимость достигается в результате изменения активности генов, отвечающих за синтез ферментных белков, участвующих в построении молекул гормонов, следовательно, в конечном итоге отвечающих за синтез гормонов. Таким образом, изменения в данном случае имеют эпигеномный характер, хотя нельзя исключить и возможность мутаций. Для того чтобы ответить на вопрос, являются ли изменения в «привыкших» клетках эпигеномными или генетическими, можно проверить, сохраняется ли свойство гормононеза-висимости в ряду: клетка — растение—клетка. С этой целью необходимо получить регенерацию в «привыкшей» ткани, а затем эксплант от регенерировавшего растения посадить на питательную среду без гормонов или без одного, из гормонов. Если в такой среде клетки будут делиться, т. е. окажутся автономными по отношению к гормонам, то это означает, что свойство гормононезависимости передается по наследству следующим поколениям, а следовательно, оно имеет генетическое происхождение. Если же на безгормональной среде клетки делиться не будут и каллусной ткани не образуют, т.е. гормононезависимость не наследуется, то это позволяет сделать вывод об эпигеномном характере изменений. Проведенные эксперименты говорят в пользу эпигеномного характера гормононезависимости в «привыкших» тканях. Однако таким путем можно проверить только те «привыкшие» клетки, которые не утратили способность к регенерации. В то же время подавляющее большинство «привыкших» клеток теряет способность к регенерации, что затрудняет использование предложенного метода для определения характера природы гормононезависимости.

В опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в растительную клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс.

В 40-х годах XX в. Браун, ученик Ф. Уайта, показал, что культура ткани корончатогалловой опухоли даже в отсутствии агробактерий, например, после гибели их под воздействием по-

вышенной температуры, сохраняет опухолевые свойства. На искусственной питательной среде без гормонов ткань корончатого галла, лишенная бактерий, продолжала интенсивно пролифе-рировать. Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксинов, чем нормальные, и продуцируют несколько цитокининов. На основании своих опытов Браун пришел к вы-воду, что растительные клетки каким-то образом трансформи-руются (превращаются) в опухолевые после воздействия Agrobacteriumtumefaciens . Было выдвинуто предположение, что агробактерии вводят в клетки растения фактор Tip{ Tumorinducingprinciple ), который за 36 ч, превращает нормальные клетки в опухолевые. В дальнейшем оказалось, что Tip пред-ставляет собой ДНК и находится в большой плазмиде агробак-терии (Ті-плазмида). Онкогенная активность может быть утра-чена в результате удаления из бактериальной клетки всей Ті-плазмиды или ее определенной части.

В 1977 г. Чилтонс сотр. доказали, что опухоли корончатого галла возникают в результате включения определенного фраг-мента Ті-плазмиды агробактерии в растительную ядерную ДНК.

Таким образом, сегмент Ті-плазмиды (Т-ДНК) интегрирует-ся в хромосому и становится частью наследственного аппарата трансформированной (опухолевой) растительной клетки. Инте-грация Т-ДНК Ті-плазмиды агробактерии в хромосому расте-ния приводит к появлению опухоли и гормононезависимому росту опухолевых клеток на искусственных питательных средах. Оба эти явления тесно связаны друг с другом, так как именно гормононезависимость, являющаяся следствием экспрессии ге-нов, контролирующих синтез ауксинов и цитокининов, приводит к дедифференцировке и пролиферации клеток.

Ті-плазмида является природным вектором (переносчиком) новых генов в растения. Путь синтеза ауксинов и цитокининов клетками опухолей, индуцированных агробактериями, иной, чем у нормальных и «привыкших» клеток. Он более простой и короткий. С помощью мутагенов стало возможным идентифи-цировать участки Т-ДНК, контролирующие изменения гормо-нальной активности. Было выяснено, что не один локус, а ряд генов ответственны за опухолевый рост.

Кроме ауксинов и цитокининов Т-ДНК детерминирует син-тез галлами нового класса аминокислот, не встречающихся в природе — опинов. Эти вещества не являются причиной возник-новения опухолей: они синтезируются в уже образовавшейся опухолевой ткани. Опухоли начинают синтез опинов в возрасте нескольких дней, например, на коланхоэ синтез опинов начина-ется на 7-й день с момента индукции опухолей. Опины — про-

изводные аминокислот, различных кетокислот и Сахаров. Они являются биологически активными соединениями нового типа, обнаруживаемыми только в тканях корончатых галлов у растений, поэтому их можно рассматривать как биохимические маркеры для клеток корончатых галлов. Опины служат питательным веществом для агробактерии, однако опухоли продолжают продуцировать эти соединения и в стерильных культурах, не содержащих агробактерии. Известно три типа опинов: нопалин, октопин и агропин. Одни штаммы бактерий индуцируют окто-пинпродуцирующие опухоли, другие нопалинпродуцирующие.

Итак, первое общее свойство «привыкших» и опухолевых тканей, индуцированных агробактериями, заключается в гормо-нонезависимости, связанной с приобретением способности интенсивно синтезировать гормоны. В галловых опухолях такая способность возникает в результате переноса чужеродного гена из бактериальной клетки в растительную. В клетках химических опухолей («привыкших» тканях) это же свойство связано, как полагают, с депрессией генов, отвечающих за синтез гормонов, однако оно может быть связано и с мутациями.

Второе общее свойство, которое вытекает из первого,— потеря способности «привыкших» и опухолевых клеток, индуцированных агробактериями, регенерировать фертильные растения. Галловые опухоли в подавляющем большинстве случаев не способны к регенерации нормального растения. Иногда они образуют тератомы (уродливые органоподобные структуры), которые не могут развиваться нормально.

«Привыкшие» ткани обычно также не регенерируют нормальных растений, их клетки утрачивают способность ко вторичной дифференцировке и морфогенезу. Однако в некоторых случаях, варьируя составы питательных сред, удается отодвинуть порог «привыкания». Следовательно, имеется резерв, использование которого позволит получать растения-регенеранты из все более длительно пассируемых тканевых культур.

КУЛЬТУРА КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ

Суспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в жидкую питательную среду с автоматическим перемешиванием. Используя фермент, например пектиназу, получаем суспензионную культуру непосредственно из ткани экспланта (лист, стебель, корень и т. д.). Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная ткань, а затем уже от нее отделяются клетки и клеточные агрегаты, в результате чего получается клеточная суспензия.

Для получения 100 мл клеточной суспензии необходимо 2—3 г свежей каллусной ткани.

Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание или встряхивание среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то деление суспензионных клеток приводит к образованию каллусной ткани.

Деление суспензионных клеток поддерживается при наличии ауксинов и цитокининов, т.е. тех гормонов, которые необходимы для индукции и роста каллусных клеток. Таким образом, суспензионные культуры представлены типичными каллусными клетками, обладающими всеми свойствами, характерными для клеток такого рода.

Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, получаемого на средах с 2,4-Д. Исключение из питательной среды ионов кальция облегчает суспендирование. Еще более облегчает этот процесс добавление в среду фермента пектиназы, который разрушает пектат кальция, склеивающий отдельные клетки.

Х- Клеточные суспензии в биотехнологии используются для получения вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными лекарственными препаратами, для промышленного выращивания клеточной биомассы и для клеточной селекции. Наряду с этим, суспензии клеток можно применять в качестве исходного материала для получения изолированных протопластов.

При использовании суспензионных культур в качестве продуцентов вторичных веществ применяют закрытые или открытые системы ферментов в периодическом или проточном режимах выращивания клеток. В закрытой системе клеточная суспензия лишена притока свежей питательной среды до конца выращивания, а в случае непрерывного режима выращивания в открытой системе питательная среда меняется на свежую. Как при периодическом, так и при проточном режимах выращивания в открытой системе клетки остаются в питательной среде и не удаляются даже при ее замене. Однако в открытых системах культивирования при замене питательной среды (периодическом или непрерывном) вместе со средой отбирается и часть суспензионных клеток.

Для работы с клеточными суспензиями необходимо знать их характеристики: жизнеспособность, плотность клеток в суспен-зионной культуре, степень агрегированности, скорость роста.

Жизнеспособность клеток определяют по их окрашиванию красителем (метиленовая синь или синь Эванса). Живые клет-ки не окрашиваются красителем вследствие непроницаемости для него клеточных мембран. В мертвые клетки краска легко проникает, и они окрашиваются в синий цвет.

Одним из основных показателей, характеризующих состояние 2клеточной суспензии, является плотность клеточной популяции. Число клеток определяют в счетной камере Фукса—Розенталя под микроскопом после мацерации (разделения клеток). В качестве мацерирующего вещества применяют хромовую кислоту (10—20 %-ная), которая гидролизует средние пластинки, соединяющие клетки.

Хорошо растущая суспензия имеет, как и каллусная культура, s-образную кривую роста. Обычно длительность пассажа составляет 14^—16 дней. При этом плотность возрастает от 5*10⁴ до 5-10⁶ кл/мл. Суспензия для субкультивирования берется в конце экспоненциальной фазы. Увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы — основные критерии роста суспензионных культур.

Качество суспензии зависит от степени агрегированности ее клеток. Агрегаты не должны содержать более 10—12 клеток. Поэтому, чтобы избавиться от крупных агрегатов, суспензии фильтруют через марлевые, найлоновые или металлические фильтры. Одновременно это позволяет освободиться от остатков экспланта или плотных кусков каллусной ткани.

Для промышленного получения продуктов вторичного синтеза из больших клеточных масс используют ферментеры большой емкости (от 20 000 и более литров), в которых проводят непрерывное культивирование клеток. Наиболее распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система. Для аэрации и перемешивания суспензии используют качалки, роллеры, ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментеры, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком.

Суспензионные культуры могут быть не только источником ценных вторичных метаболитов, но в них выявлены также новые необычные соединения, например, камптотецин, харрингтонин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов) и др.

Следует отметить, что деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных метаболитов достигает максимума в стационарной фазе роста.

КУЛЬТУРА ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК

Для генетических и физиологических исследований, а также для практического использования в клеточной селекции очень

ценным является культивирование отдельных клеток. Получение клона-потомства одиночной клетки помогает разобраться в причинах генетической неоднородности каллусных клеток, так как наблюдения в данном случае проводятся на ткани, полученной не из гетерогенного экспланта, а из одной клетки.

Одиночная гибридная клетка, выделенная из культуры изолированных протопластов, при дальнейшем ее делении позволяет получить клон, состоящий из гибридных клеток. Это намного облегчает работу исследователя, так как устраняет необходимость отбора потомства в культуре изолированных протопластов от негибридных, что представляет значительные трудности. Кроме того, сам процесс соматической гибридизации лучше наблюдать, если работа ведется с одиночными протопластами.

Выделяют одиночные клетки из клеточных суспензий, из тканей растений, например, из мезофилла листа после его мацерации ферментами, из культуры изолированных протопластов после восстановления клеточной стенки.

Для получения одноклеточной фракции суспензионной культуры иногда достаточно простого отстаивания в колбе в течение 15—30 мин. При этом крупные агрегаты оседают на дно колбы, а надосадочная фракция содержит только одиночные клетки или мелкие агрегаты. В том случае, когда при отстаивании не удается получить одноклеточную фракцию, применяют мацерирующие ферменты, центрифугирование в градиенте сахарозы или фильтрование через сита (найлоновые или металлические).

Трудности культивирования одиночных клеток связаны с тем, что отдельная клетка не делится в тех условиях, в которых хорошо растет каллусная ткань. Для того чтобы заставить одиночные клетки делиться, разработаны специальные методы. В I960 г. Джонсон предложил метод «няньки», при котором функцию «няньки», стимулирующей деление одиночной клетки, выполняют кусочки каллусной ткани, отделенные от нее фильтровальной бумагой. В присутствии «няньки» одиночная клетка делится и дает индивидуальную колонию клеток — клон.

Другой метод основан на использовании очень малых объемов богатой питательной среды и представляет собой культивирование одиночных клеток в микрокапле в чашке Купрака объемом 20 мкл. Метод предложен академиком Ю.Ю. Глебой. В микрокаплях удобно наблюдать за получением и делением клеток при соматической гибридизации.

Для индукции клеточных делений у одиночной клетки можно использовать также «кормящий слой» (активно делящиеся клетки

суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка) (рис. 1.3). Стимулирует клеточное деление и кондиционирование среды, для чего в нее добавляют питательную среду от интенсивно делящейся культуры клеток. Кондиционирующий фактор получают при фильтровании клеточной суспензии в экспоненциальной фазе роста через бактериальный фильтр; По сути дела все перечисленные методы основаны на использовании выделений из делящихся клеток — кондиционирующего фактора.

Несмотря на многочисленные по-пытки определить химическую природу и раскрыть механизм действия кондиционирующего фактора на деление клеток, ясности пока нет. Однако уверенно можно сказать, что этот фактор термостабилен, водорас-творим, включает низкомолекулярные вещества и не заменяется фито-

гормонами (А.И. Павлова, Р.Г. Бутенко, 1969). К сказанному можно добавить также, что вещество стабильно при рН 4-11, молекулярная масса его ~ 700 Д и этот фактор является синер-гистом брассиностероида (Bellincampi, Morpurgo, 1987). Таким образом, исследования показали, что это не чисто химическое вещество, а сумма факторов, которые выделяются из клетки.

Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 461; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 234 5 6 7 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!