Определение количества хлоридов в слюне титрационным аргентометрическим осадочным методом Левинсона

Принцип метода

Ионы Ag⁺ способны к образованию нерастворимых солей с ионами Cl^–. Титрование хлорид-ионов азотнокислым серебром проводят в присутствии индикатора К₂СrO₄. Количество осаждающего вещества (AgNO₃) эквивалентно содержанию ионов Cl^–, и при достижении эквивалентной точки титрования избыток ионов Ag⁺ образует с индикатором соединение кирпично-красного цвета (Ag₂CrО₄).

Проведение анализа

Для осаждения белков слюны в двух пробирках готовят смесь из 5 мл 0,45 % раствора ZnSO4 и 1 мл 0,1 М раствора NaOH. Затем в 1-ю пробирку (опыт) вносят 0,1 мл слюны, во 2-ю (контроль) ‑ 0,1 мл дистиллированной воды. Пробирки кипятят в течение 3 минут над пламенем спиртовки. Затем содержимое пробирок фильтруют через воронки с ватным фильтром в колбочки для титрования. Осадок на ватном фильтре промывают два раза водой (по 3 мл). К фильтрату приливают 2 капли 2 % раствора К₂СrO₄ и для осаждения ионов хлора титруют раствором AgNO₃ до изменения жёлтого цвета раствора на кирпично-красный.

Расчёт

Содержание хлоридов в слюне в мг% рассчитывают по формуле

С (мг%) = (Vопыт – Vконтр) · 0,355 · 1000 ,

где: Vопыт – объём AgNO₃, израсходованный на титрование опытного раствора; Vконтр – объём AgNO₃, пошедший на титрование контрольного раствора; 0,355 – коэффициент для пересчёта результата в мг хлора на 0,1 мл слюны; 1000 ‑ коэффициент для пересчёта содержания хлора в мг на 100 мл (мг%).

Для пересчёта показателя хлоридов из мг% в ммоль/л (единицы СИ) используют коэффициент 0,282

С (ммоль/л) = С (мг%) · 0,282

Нормальные величины

Ротовая жидкость 20–40 ммоль/л.

Практическое значение

Ионы Cl^– участвуют в поддержании заряда мицелл и коллоидоустойчивости слюны. Избыток хлорид‑ионов снижает коллоидную устойчивость ротовой жидкости и минерализующую способность мицелл в отношении зубной эмали.

Определение содержания хлоридов в плазме крови колориметрическим методом

Принцип метода

Хлорид-ионы освобождают из хлораниловокислой ртути (II) хлораниловую кислоту, содержание которой определяется фотометрически, количество хлораниловой кислоты пропорционально концентрации хлорид-ионов в пробе.

Проведение анализа

	Опыт, мкл	Контроль, мл
Плазма крови Стандартный раствор NaCl Раствор хлораниловокислой ртути	20 ‑ 2000	‑ 20 2000
	1 мин энергично встряхивают и инкубируют 10 минут
Эфир	2 капли	2 капли
	Перемешивают пробы и фильтруют через смоченные водой фильтры
Колориметрируют обе пробы против воды при длине волны 530 нм (зелёный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Расчёт

Количество хлорид-ионов в плазме крови рассчитывают по формуле

Содержание хлоридов [ммоль/л] = ,

где: Е_ОП и Е_СТ ‑ оптическая плотность опытной и стандартной проб,
С_СТ ‑ концентрация хлоридов в стандартном растворе (100 ммоль/л).

Нормальные величины

Плазма крови 94‑110 ммоль/л

Рассчитывают процентное соотношение концентрации хлорид ионов (К) в ротовой жидкости и концентрации хлорид-ионов в плазме крови.

К (%) = (С_РЖ / С_ПЛ) · 100 % ,

где: С_РЖ ‑ концентрации хлоридов в ротовой жидкости (моль/л),
С_ПЛ ‑ концентрация хлоридов в плазме крови (ммоль/л).

Практическое значение

Ионы Сl^– являются основными внеклеточными анионами, присутствуют во всех жидкостях организма. Гиперхлоремия наблюдается при обезвоживании, вызванном недостаточным поступлением жидкости, при повышенном поступлении хлорида натрия, декомпенсации сердца, метаболическом ацидозе и респираторном алкалозе, снижении экскреции хлорид-ионов с мочой при нефритах, отравлении салицилатами, приёме глюкокортикоидов. Гипохлоремия встречается чаще и возникает при недостаточном поступлении хлоридов и избыточной потере через желудочно-кишечный тракт при заболеваниях, сопровождающихся неукротимой рвотой и поносом, при стенозе привратника, длительном потоотделении, почечном и сахарном диабете, сморщенной почке, в результате перераспределения и задержки хлоридов в повреждённых тканях при хронических воспалительных процессах, абсцессах, некрозах.

Оформление работы

Указывают принцип метода, регистрируют данные, делают расчёты, сравнивают полученные результаты с нормальными значениями показателя хлоридов в ротовой жидкости и плазме крови, делают выводы о наличии/отсутствии отклонений.

Задание

Провести сравнительную оценку полученных на лабораторных работах показателей содержания хлоридов, фосфатов, ионов кальция в крови с аналогичными показателями в слюне с целью охарактеризовать влияние минерального обмена организма на минеральный обмен в слюне. Предположить и обосновать пути и возможности гормональной регуляции минерального обмена слюны.

Лабораторная работа 5.
Обнаружение роданидов в ротовой жидкости

В ротовой жидкости содержатся роданиды (тиоцианаты), которые являются продуктом сульфирования цианидов (солей синильной кислоты) тиосульфатом натрия с помощью фермента роданазы:

КСN + Na₂S₂O₃ Na₂SO₃ + KSCN

Роданиды активируют пероксидазы слюны, участвующие в метаболизме пероксидов, и тем самым оказывать защитное действие. В гранулоцитах, поступающих в полость рта с жидкостью десневой борозды, локализован фермент лактопероксидаза, который окисляет имеющийся в слюне роданид с помощью перекиси водорода в бактерицидный гипотиоционат:

SCN^– + H₂O₂ OSCN^– + H₂O

Содержание роданидов в слюне зависит от контакта человека с табачным дымом. В слюне курильщиков их концентрация значительно больше по сравнению с таковой у некурящих. Высокие концентрации роданидов в ротовой жидкости вызывают токсические эффекты в пародонте.

Принцип метода

Роданиды в слюне обнаруживают по появлению красного окрашивания при добавлении к слюне хлорного железа. Реакция обусловлена образованием роданистой соли трехвалентного железа в результате взаимодействия ионов Fe³⁺ и SCN^– и образованием различных комплексов, имеющих состав от Fe(H₂O)₅(NCS)²⁺ до Fe(NCS)₆^3–. Некоторые органические соединения (например, соли лимонной и уксусной кислот) препятствуют образованию окраски.

Необходимые реактивы

1) 0,01 % раствор хлорного железа, 2) 2 % раствор соляной кислоты.

Материал для исследования

Слюна некурящего человека и курильщика.

Проведение анализа

Готовят две пробы: опытную (слюна курильщика) и контрольную (слюна некурящего человека). В каждую пробирку к 10 каплям слюны добавляют по 2 капли 2 % раствора соляной кислоты и по 2 капли раствора хлорного железа (FeCl₃). В результате появления роданида железа развивается красное окрашивание разной интенсивности в зависимости от концентрации ионов роданида.

Нормальные величины

Ротовая жидкость 0,5‑1,2 ммоль/л

(визуально окраска не дифференцируется).

Практическое значение

Основным путём поступления лейкоцитов в полость рта является десневая бороздка и её жидкость. В местах повреждения слизистой оболочки полости рта происходит дополнительная эмиграция гранулоцитов из крови, которые принимают участие в защитных реакциях. Один из механизмов защиты основан на способности гранулоцитов к продукции гипотиоцианата. Гипотиоционат чрезвычайно бактерициден и совместно с пероксидом водорода и другими активными формами кислорода действует на микрофлору в полости рта (в том числе кариесогенную). Однако высокие концентрации роданидов оказывают токсическое влияние на пародонт, способствуя развитию воспалительных процессов.

Содержание роданидов (тиоцианатов) достаточно велико в слюне курильщиков (в 2‑10 раз выше, чем у некурящих людей), что связано с поступлением в их организм синильной кислоты, содержащейся в табачном дыме. Чем выше концентрация тиоцианатов в слюне, тем более заметной становится окраска.

Оформление работы

Указывают принцип метода, фиксируют результаты, сравнивают полученные у разных людей данные с нормальными величинами, делают вывод о наличии/отсутствии патологических отклонений и значении показателя.

Лабораторная работа 6.
Определение активности a–амилазы в слюне, плазме крови и моче

a-Амилаза (диастаза, 1,4–a–D–глюкангидролаза, КФ 3.2.1.1) катализирует гидролиз a–1,4–гликозидных связей крахмала до декстринов и мальтозы:

Крахмал + Н₂О мальтоза + декстрины

a‑Амилаза тканеспецифична, её продуцируют слюнные железы и поджелудочная железа. Главная роль a‑амилазы в организме ‑ пищеварительная, поэтому фермент секретируется экзокринно, поступая, соответственно, в ротовую полость и просвет 12-пёрстной кишки. До 70 % фермента в полость рта секретируют околоушные железы. В результате естественного старения и отмирания клеток слюнных и поджелужочной желёз молекулы фермента попадают в кровь, поэтому в плазме крови всегда в небольшом количестве содержится a‑амилаза двух изоферментных типов: слюнной S‑тип (около 70 %) и панкреатический P‑тип (около 30 %). Фермент имеет относительно низкую молекулярную массу (около 48000 D), в связи с чем фильтруется в почечных клубочках и присутствует в моче. Соотношение изоферментов в моче иное, чем в крови: Р‑тип – 70 %, S‑тип – до 30 %. Хлориды и иодиды повышают активность фермента. При нарушении целостности железистых клеток, вырабатывающих a‑амилазу, процессам цитолиза сопутствует повышение концентрации и активности фермента в плазме крови и моче, что используют с целью диагностики заболеваний слюнных и поджелудочной желёз. В моче этот фермент традиционно называют «диастаза».

Энзиматический кинетический метод,
оптимизированный для биологических жидкостей

Принцип метода

a‑Амилаза катализирует реакцию гидролитического преобразования специфического углеводного субстрата, протекающую с отщеплением от олигосахарида 2‑хлор‑4‑нитрофенола:

2‑Cl‑4‑нитрофенил‑олигоCAX + Н₂О → 2‑Cl‑4‑нитрофенол + олигоCAX

Скорость образования 2‑хлор‑4‑нитрофенола пропорциональна активности фермента и определяется фотометрически.

Необходимые реактивы

Стандартный набор: 1) буферный раствор (0,05 М MFS‑буфер (pH 6,0) и 5 ммоль/л раствор хлористого кальция), 2) лиофилизированный субстрат. Для приготовления рабочего реагента, содержащего субстрат в концентрации 2,5 ммоль/л, содержимое флакона с субстратом растворяют в буфере при аккуратном перемешивании и оставляют на 3‑5 минут для стабилизации.

Материал для исследования

1) Ротовая жидкость (разведение 10‑50 раз), 2) сыворотка крови, 3) моча.

Проведение анализа

В кювете фотометра с длиной оптического пути 1 см смешивают рабочий реагент и исследуемую жидкость в соотношении 50:1 (рекомендуется использовать 3,5 мл рабочего реагента и 70 мкл сыворотки крови или разведённой слюны) и через 10 секунд измеряют оптическую плотность раствора (Е₀) при длине волны 405 нм против воздуха. Измерение повторяют точно (по секундомеру) через 1 мин (Е₁), 2 мин (Е₂), 3 мин (Е₃), не вынимая кювету из прибора.

Расчёт

Считают среднее значение изменения оптической плотности в минуту ΔЕ/мин.

ΔЕ/мин = [(Е₁ ‑ Е₀) + (Е₂ ‑ Е₁) + (Е₃ ‑ Е₂)] : 3

Расчёт активности a‑амилазы производят по одной из формул (в зависимости от того, в каких единицах необходимо представить активность фермента):

Активность a‑амилазы [Ед/л] = ΔЕ/мин · 3806

Активность a‑амилазы [нмоль/(с · л)] = ΔЕ/мин · 63446

Нормальные величины

Значения активности a‑амилазы в сыворотке зависят от температуры анализа:

при 25 °С ‑ до 120 Ед/л или до 2000 нмоль/(с · л)

при 30 °С ‑ до 160 Ед/л или до 2670 нмоль/(с · л)

при 37 °С ‑ до 220 Ед/л или до 3670 нмоль/(с · л)

Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 161; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 26 27 28 29 303132 33 34 35 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!