Работа относится к категории учебно-исследовательских (УИРС).
I этап. В ряд флаконов помещают одинаковые пластинки срезов зуба.
Затем во все флаконы добавляют по 5 мл соответствующей жидкости (в каждой жидкости необходимо заранее измерить значение рН с помощью рН-метра или индикаторной бумаги и содержание кальция (см. лабораторная работа 2)):
№1 – ротовая жидкость (для ротовой жидкости разных людей под №1 может быть несколько флаконов, отмеченных разными добавочными литерами: 1а, 1б, 1в и др.), №2 – Н2О дистиллированная, №3 – кислая среда с рН=5, №4 – слабокислая среда с рН=6, №5 – нейтральная среда с рН=7 (контроль), №6 – щелочная среда с рН=8, далее – жидкости «Кока-кола», «Спрайт», «Фанта» и т.п.
II этап. Через 1 ч образцы зубов достают из флаконов пинцетом, отмывают и оценивают их состояние, сравнивая с контрольным образцом. Во всех растворах измеряют значение рН, проводят анализ на содержание Са. Помещают образцы обратно во флаконы, оставляют на холоде до следующего занятия.
III этап. Окончательную оценку результатов проводят на следующем занятии. Достают и отмывают образцы зубов, регистрируют их состояние, сравнивая с контрольным образцом. В каждом растворе заново измеряют значение рН и анализируют содержание кальция (см. лабораторная работа 2).
Оформление работы
Фиксируют в виде таблицы результаты, полученные на I, II, III этапах, сравнивают их, делают вывод о наличии отклонений под влиянием среды
| Иссле-
| Слюна | Н2О (дист) | рН=5 | рН=6 | рН=7 | рН=8 | Кока-кола, Спрайт, Фанта или т.п. | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |||||
| I | рН | ||||||||||||
| Са | Е | ||||||||||||
| С | |||||||||||||
| II | рН | ||||||||||||
| Са | Е | ||||||||||||
| С | |||||||||||||
| III | рН | ||||||||||||
| Са | Е | ||||||||||||
| С | |||||||||||||
Е – экстинкция, С – концентрация кальция, найденная по формуле (работа 2).
Самостоятельная работа
1). Ознакомиться с серией ИФА-тест-систем, используемых для оценки заболеваний, связанных с нарушениями обмена в костных тканях.
2). Усвоить комплексность подхода, применяемого в лабораторной диагностике нарушений обмена.
3). Сформировать представление о широте диапазона показателей, влияющих на минерализацию и общее состояние костной ткани.
Актуальность.
На основе ИФА разработаны серии тест-наборов, которые могут быть использованы в диагностике состояния соединительной и костной тканей. Эти ткани широко представлены в зоне полости рта. Биохимические показатели метаболизма костной ткани подразделяют на маркёры резорбции и маркёры образования. Процессы обмена в костной ткани обычно характеризуют с помощью ряда показателей, определяемых в плазме крови:
|
|
|
1) маркёры образования кости: содержание остеокальцина, проколлагеновых С‑ и N‑пропептидов, активность специфической костной щелочной фосфатазы; 2) маркёры резорбции кости: содержание пиридинолина, дезоксипиридинолина, N‑ и С‑телопептидов (продуктов деградации коллагена I типа), активность тартрат-резистентной кислой фосфатазы.
В моче также определяют продукты распада кости: кроме уровня N‑ и С‑телопептидов коллагена I типа, дезоксипиридинолина и пиридинолина, здесь оценивают количество кальция, гидроксипролина, гликозидов гидроксилизина.
Ниже приведён перечень ИФА-тест-систем, применяемых в мировой практике для анализа маркёров обмена костной ткани при диагностике нарушений и мониторинге проводимой терапии «остеотропных» заболеваний с указанием названий ведущих мировых фирм-производителей.
|
|
|
| Фирма-произ-водитель | Наименование ИФА-набора, количество определений | ||
| Nordic | CrossLaps (определение в моче С-концевых телопептидов, образующихся при деградации коллагена I типа), 96 | ||
| Serum CrossLaps One Step (определение в сыворотке крови С‑концевых телопептидов, образующихся при | |||
| N‑MID Остеокальцин, 96 | |||
| BCM Diagnostics | Костный изофермент щелочной фосфатазы (ВАР), 96 | ||
| DSL | Паратиреоидный гормон, 96 | ||
| Кальцитонин человека, 96 | |||
| Кальцитонин лосося, 96 | |||
| Рецептор 1,25(ОН)2витамина D3 | |||
| IDS | 25(ОН)витамин D, 96 | ||
| 1,25(ОН)2витамин D3 | |||
| Biomedica | Остеопротегерин, 96 | ||
| RANKL, 96 | |||
| Катепсин, 96 | |||
| Penisula | Остеогенный пептид роста, 96 | ||
Диагностическое значение ИФА-систем,
рекомендуемых для оценки маркёров метаболизма костной ткани
С‑телопептиды. При разрушении матрикса кости, дентина и цемента зуба содержащийся здесь коллаген I типа расщепляется, небольшие фрагменты и специфические аминокислоты поступают в кровяное русло, выводятся с мочой.
Количественный анализ продуктов деградации коллагена I типа позволяет оценить скорость костной резорбции. С-телопептидные фрагменты считают наиболее высокоспецифичными маркёрами. Отщепление С‑телопептида происходит на начальном этапе деградации коллагена I типа, поэтому другие метаболиты коллагена практически не влияют на его концентрацию в плазме крови. Продукты расщепления С-телопептида коллагена состоят из 2 октапептидов, связанных поперечной сшивкой и находящихся в β‑форме (эти структуры называют β‑Crosslaps). Они попадают в кровь, где их количество можно оценить методом ИФА. Здесь учитывается, что во вновь сформированной кости концевые линейные последовательности октапептидов содержат α‑аспарагиновую кислоту, но по мере старения кости α‑аспарагиновая кислота изомеризуется в β‑форму. Моноклональные антитела специфически распознают линейные октапептиды, содержащие именно β‑аспарагиновую кислоту.
|
|
|
Принцип определения количества С‑телопептида с помощью тест‑системы «Elecsys β-crosslaps/Serum»
Одновременно с С-телопептидами в плазме крови появляется тартратрезистентная кислая фосфатаза.
Тартрат‑резистентная кислая фосфатаза (TRACP 5B) секретируется остеокластами, попадает в повышенном количестве в кровоток при увеличении количества остеокластов и возрастании их активности. Тест‑система фирмы БиоХимМак позволяет определять только активные формы TRACP‑молекул, секретируемые во внеклеточное пространство кости, и не детектирует старые, инактивированные молекулы TRACP или их фрагменты, которые могли появиться во время сбора образца крови.
Костный изофермент щелочной фосфатазы (ВАР) представляет собой тетрамерный гликопротеин, обнаруживаемый на клеточной поверхности остеобластов. Количественная оценка ВАР, как маркёра костного метаболизма, дает полезную информацию о костном ремоделировании у пациентов и влиянии антирезорбционной терапии на активность заболевания.
Остеокальцин. Активные остеобласты продуцируют специфический маркёр ремоделирования кости – gla-белок остеокальцин, содержащий γ‑карбоксиглутаминовую кислоту, за счёт чего прочно связывается с Са2+ гидроксиапатитов в костях и зубах. Попадая в кровь, остеокальцин быстро расщепляется на несколько фрагментов разной длины, их обнаруживают методом ИФА. Диагностикум создан на основе двух высокоспецифичных моноклональных антител, одно из которых «узнаёт» среднюю часть полипептида (N‑MID фрагмент), другое ‑ N‑концевой участок остеокальцина. Концентрация обоих фрагментов измеряется по хемилюминесценции (ХЛ) рутения, которым мечены антитела.
Принцип определения количества остеокальцина с помощью
тест‑системы «Elecsys N-MID osteocalcin test»
Тест‑системы Остеокальцин и CrossLaps рекомендованы международным фондом изучения остеопороза как маркеры мониторинга антирезорбционной терапии. Маркёры костной резорбции определяют до начала терапии, затем через 3‑6 мес. Маркёры образования костей ‑ до терапии и 6 мес спустя. В случае неоднозначных изменений маркёры измеряют третий раз через 3 мес.
Гомеостаз кальция в организме обеспечивает гормональная система «паратгормон‑кальцитриолы‑кальцитонин», её основная функция ‑ регуляция движения Са2+ и фосфатов в организме, поддержание постоянства уровня Са2+ в крови. Эти гормоны контролируют процесс резорбции кости: паратгормон и (1,25(ОН)2D3) его усиливают, а кальцитонин и 24,25(ОН)2D3 его тормозят.
1) Паратиреоидный гормон (ПТГ) синтезируют паратиреоидные железы в ответ на уменьшение внеклеточной концентрации Са. ПТГ приводит к поступлению в кровь кальция и фосфатов за счёт стимуляции остеокластов и резорбции кости и к повышению всасывания Са в кишечнике и реабсорбции Са в канальцах почек – вследствие активации образования кальцитриола. Наиболее распространены методы ИФА, основанные на выявлении С-концевого или средних фрагментов гормона. При недостаточности почек С-концевые фрагменты ПТГ накапливаются в крови, и определяемый уровень гормона оказывается искусственно завышен. Поэтому разработана диагностически более значимая тест-система на основе 2 высокоспецифичных поликлональных антител, каждое из них реагирует с эпитопами именно N-терминальной части интактного ПТГ.
2) Витамин D‑зависимые маркеры.
25(ОН)-витамин D является главным циркулирующим метаболитом витамина D, рецепторы к нему представлены в мышечной ткани. Несмотря на то, что биологически наиболее активен витамин в форме синтезируемого в почках 1,25(ОН)2D3, методом диагностики и контроля лечения гиповитаминоза D и ассоциированных заболеваний признана оценка циркулирующего 25(ОН)D3.
1,25(ОН)2витамин D3 (кальцитриол) – прямой антирахитический фактор, повышает уровень Са в крови, по механизму действия подобен стероидным гормонам. Измерение содержания 1,25(OH)2D3 не очень выгодно для оценки общего статуса витамина D, его используют только с целью дифференциальной диагностики заболеваний и оценки эффективности 1,25(OH)2D3-‑терапии.
Рецептор 1,25(ОН)2витамина D3. Кальцитриол действует через специфические рецепторы к витамину D. Главными органами-мишенями выступают кости, кишечник, почки, также рецепторы обнаружены, по меньшей мере, в 35 органах и тканях. Иногда важно определять именно концентрацию рецептора витамина D, поскольку прогрессирование костной патологии может быть связано с развитием устойчивости к витамину D (дефицитом рецепторов витамина D).
3) Кальцитонин человека. Синтезируется и секретируется парафолликулярными С-клетками щитовидной железы. Основное действие ‑ снижение уровня Са в плазме через ингибирование активности остеокластов, приводящее к снижению выхода Са из кости. Секрецию его стимулирует рост концентрации Са в плазме, регулируют желудочно-кишечные пептиды, эстрогены, витамин D.
Кальцитонин лосося (Salmon Calcitonin) часто используют с целью подавления костной резорбции при лечении остеопороза, когда важно поддерживать его концентрацию на терапевтически определённом уровне, для чего проводят мониторинг препарата в крови ИФА-тест-системами.
Остеопротегерин (OPG) и RANKL (Receptor activator of NF-kappa B ligand ‑ лиганд рецептора активатора ядерного фактора каппа B) играют ключевую роль в регуляции ремоделирования костной ткани. Остеобласты определяют развитие, дифференцировку, функционирование остеокластов и продуцируют фактор дифференцировки остеокластов – RANKL. Предшественники остеокластов в ходе межклеточного взаимодействия с остеобластами узнают фактор RANKL и воспринимают его как сигнал к началу дифференцировки в остеокласты. Рост экспрессии RANKL приводит к резорбции костной ткани и ингибированию апоптоза остеокластов.
Экспрессию мРНК RANKL повышают паратгормон, витамин D, интерлейкины 1 и 11, простагландин Е2. Остеопротегерин ‑ растворимый гликопротеин из семейства рецепторов факторов некроза опухоли, секретируется клетками стромы, в том числе остеобластами. Это ключевой ингибитор дифференцировки остеокластов (подавляет конечную стадию процесса), индуцирует их апоптоз. OPG, являясь «ловушкой» рецепторов, конкурентно ингибирует связывание RANKL с рецептором RANK, чем ингибирует мобилизацию, пролиферацию и активацию остеокластов. OPG повышает массу кости, снижает гиперкальциемию, предупреждает кальцификацию больших артерий. Баланс между продукцией RANKL и OPG во многом определяет характер ремоделирования кости. Система RANKL/RANK/OPG занимает центральное место в регуляции резорбтивной активности остеокластов.
Катепсин. Фермент деградации белков, активируется в процессе резорбции костного матрикса.
Остеогенный пептид роста. Небольшой регуляторный пептид, вырабатываемый в костной ткани, нужен для правильного моделирования и ремоделирования кости.
Задания для самоконтроля
1. Указать процентное содержание веществ в костной и зубных тканях.
| Ткани | Минеральные вещества | Кальций и фосфаты | Органические вещества | Белок | Вода |
| Кость | |||||
| Эмаль | |||||
| Дентин | |||||
| Цемент | |||||
| Пульпа |
2. Указать влияние концентрации ионов кальция в крови на синтез/секрецию гормонально активных веществ, регулирующих кальций-фосфорный обмен. Обозначить повышение синтеза/секреции – ↑, снижение – ↓.
| Уровень Са2+ | Синтез кальцитриола (1,25(ОН)2D3) | Секреция паратирина | Секреция кальцитонина |
| Повышен | |||
| Снижен |
3. Подобрать пары, состоящие из формулы фосфатной соли кальция и соответствующего ей названия.
| Формула | Название |
| 1. СаНРО4•2Н2О | А. Гидроксиапатит |
| 2. Са8(НРО4)2(РО4)4•5Н2О | Б. Фторапатит |
| 3. Са10(РО4)6(ОН)2 | В. Магниевый апатит |
| 4. Са10(РО4)6F2 | Г. Брушит |
| 5. Са10(РО4)5(НСО3)(ОН)2 | Д. Карбонатный апатит |
| 6. Са9Mg(РО4)6(ОН)2 | Е. Октакальций фосфат |
Вопросы для самоконтроля
1) Строение, органический и минеральный состав и функции костной ткани и твёрдых тканей зуба. Сходство и различие твердых тканей.
2) Органические соединения кости, особенности белков и углеводов. Ферменты, цитрат, пирофосфат, фосфолипиды в построении и минерализации кости.
3) Особенности химического состава эмали, молекулярно-функциональная модель структуры эмали. Белки эмбриональной и зрелой эмали, их роль в минерализации. Пути поступления веществ в эмаль зуба.
4) Химический состав и функции дентина и цемента, виды и особенности дентина, демента. Специфические белки. Минерализация разных видов дентина.
5) Характеристика и основные показатели минерального обмена. Макроэлементы Са, Р Mg, свойства кальциевых солей фосфорной кислоты. Обмен кальция и фосфатов, роль в обмене зуба и кости. Внутри- и внеклеточный кальций, участие в метаболизме и регуляции. Са-связывающие белки.
6) Теории минерализации кости и зуба. Механизмы минерализации кости, роль органических и минеральных компонентов, источники энергии. Витамины, гормоны, белковые и небелковые факторы в регуляции обмена кости и зуба.
7) Ремоделирование кости, специфика альвеолярного отростка. Метаболические особенности и регуляция активности остеоклавтов и остеобластов.
8) Фтор, стронций и другие микроэлементы, роль в процессах жизнедеятельности. Влияние на апатиты, кость и ткани зуба. Гипофтороз, флюороз зубов.
9) Поверхностные образования на зубах, образование и состав. Простые сахара, гликолиз и «метаболический взрыв» анаэробной микрофлоры, углеводно-фосфорный обмен, судьба лактата, муреин и синтез стромы зубного налета. Минералы и минерализация бляшки. Биохимия кариеса.
Тестовые задания
Выбрать один правильный ответ.
1. Основной структурной единицей молекулы коллагена I типа является
1) триада (гли-про-Х)
2) триада (про-гли-лиз)
3) комплекс (про-гидроксипро)
4) комплекс пиридинолина
5) комплекс пирролидина
2. Специфичность коллагеназы проявляется в гидролизе пептидных связей
1) между ГЛИ-ЛЕЙ в каждой из 3-х цепей по всей длине коллагена
2) между ГЛИ-ЛИЗ в 3-х местах по длине молекулы коллагена
3) между ГЛИ-гидроксиПРО на 1\3 от С-конца молекулы коллагена
4) сразу 3 цепей в середине коллагена-I, с разрывом пополам
5) между ГЛИ-гидроксиЛИЗ на 1\3 от N-конца молекулы коллагена
3. Молекулы эластина соединительной ткани стабилизированы межмолекулярными ковалентными сшивками
1) пиридинолина
2) норлейцина
3) изодесмозина
4) гидроксипиррола
5) гидроксипиридинолина
4. К классу гиалектанов – больших протеогликанов межклеточного матрикса относится
1) синдекан
2) агрин
3) кератокан
4) агрекан
5) декорин
5. У людей с поврежденными почками причиной развития рахитоподобного процесса с деминерализацией костей на фоне сбалансированной диеты является
1) потеря кальциферол-переносящего белка
2) нарушения образования 1,25-дигидроксикальциферола
3) нарушения образования 25-гидроксихолекальциферола
4) нарушения всасывания витамина D
6. В моделировании кости активное участие принимает
1) лактатдегидрогеназа
2) щелочная фосфатаза
3) кислая фосфатаза
4) пируваткарбоксилаза
5) аминотрансфераза
7. Белок, стимулирующий рост дентина, относят к
1) морфогенам
2) митогенам
3) трансформирующим факторам
4) факторам хемотаксиса
5) факторам хемоаттракции
8. По механизму гомогенной нуклеации минерализуется дентин
1) вторичный
2) третичный
3) перитубулярный
4) интертубулярный
5) плащевой
9. В органической матрице зрелой эмали структурная роль отсутствует у
1) Са‑связывающих белков
2) фосфолипидов
3) белков, нерастворимых в ЭДТА и соляной кислоте
4) водорастворимых белков
10. При раннем кариесе главным условием обратимости деминерализации эмали является
1) связывание ионов кальция, фосфатов со свободными ГЛУ и ЛИЗ
2) сохранение структуры белковой матрицы эмали
3) выравнивание соотношения Са/Р в слюне до 1
4) доставка максимального количества F для укрепления эмали
5) препятствие потере критических 10 % Са кристаллами апатитов
Ситуационные задачи
Ответы подробно пояснить.
1. При медицинском обследовании подростка, обратившегося к врачу с жалобами на остановку роста костей, было выявлено, что пациент плохо видит в темноте на фоне развития поражений глазного яблока в виде ксерофтальмии, имеет признаки гастрита, колита и цистита. Указать, с недостаточностью какого витамина это связано и какова роль данного витамина в процессах минерализации и возникновении симптомов развившихся заболеваний.
2. У пациента на рентгенограммах выявлена деструкция костной ткани, в плазме крови повышено содержание ионизированного кальция, в моче – содержание фосфатов. Назвать возможную причину наблюдаемых явлений. Пояснить, какие основные минеральные компоненты участвуют в построении костной ткани, какие гормоны регулируют фосфорно-кальциевый обмен, избыток какого гормона приводит к данным изменениям. Указать, активность какого фермента будет повышена в костной ткани при её разрушении.
3. У ребенка отмечается изъеденность эмали и темно-коричневые пятна. В эмали обнаружено высокое содержание фтора, белка и пониженное содержание кальция. Указать, для какого заболевания характерна такая клиническая картина. Пояснить, сколько белка содержится в здоровой эмали взрослого человека, назвать основные белки эмали, роль фтора в составе эмали. Назвать, какова концентрация фтора в питьевой воде в норме.
4. Анализ мочи у больного, госпитализированного в стационар по поводу тяжелой болезни сердца и длительное время находящегося в постели в неподвижном состоянии, показал нарастание содержания солей кальция. Пояснить, связано ли это с основной болезнью или с какой-либо другой причиной.
ТЕМА
"Соединительная, костная и зубные ткани"
(контрольное занятие по разделу 10)
Вопросы для самоподготовки
Соединительная ткань
1. Структура соединительной ткани, роль в организме. Характеристика межклеточного органического матрикса. Этапы синтеза, ферменты деградации.
2. Коллаген, характеристика типов и групп коллагена. Основные этапы синтеза коллагена и механизм формирования коллагенового волокна. Строение коллагенового волокна. Нарушения синтеза коллагена.
3. Неколлагеновые белки соединительной ткани: эластин, фибронектин, ламинин. Особенности строения и функции.
4. Классификация и характеристика протеогликанов. Протеогликаны матрикса, клеточной и базальной мембран. Специфика углеводного компонента.
5. Регуляция метаболизма соединительной ткани. Нарушения образования соединительной ткани. Металлопротеиназы, гиалуронидаза и другие ферменты деградации матрикса. Болезни соединительной ткани.
6. Пульпа зуба как вариант специализированной соединительной ткани: состав, функции. Особенности фибробластов и клеток защиты (макрофаги, лимфоциты, антиген-представляющие и тучные клетки) пульпы, их взаимодействие. Биохимические изменения в депульпированном зубе.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 134; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!