Определение активности фермента в плазме крови
Проведение анализа
| Реагенты, мкл | Опыт | Контроль |
| Буферный раствор | 1000 | 1000 |
| Плазма/сыворотка крови | 20 | – |
| Инкубируют при 37ºС в течение 5 минут | ||
| Раствор субстрата | 200 | 200 |
| Инкубируют при 37ºС в течение 10 минут | ||
| Раствор ингибитора | 500 | 500 |
| Стандартный раствор | – | 20 |
| Перемешивают и измеряют экстинкцию проб против воды при длине волны 405 нм (400‑420 нм, сине-фиолетовый с/фильтр) в кювете 10 мм | ||
Расчёт
Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) находят по формуле:
Активность ЩФ [мккат/л] = 10,263 ´ (ЕОП – ЕК) ,
где: ЕОП и ЕК ‑ оптическая плотность опытной и контрольной проб,
10,263 ‑ коэффициент пересчёта в единицы СИ.
Нормальные величины
Плазма крови 0,90‑2,29 мккат/л = 278‑830 ммоль/(с×л) = 0,02‑0,05 МЕ
Практическое значение
Повышение активности щелочной фосфатазы в крови наблюдается при костных заболеваниях (переломы, остеопороз, рахит, размягчение костной ткани, доброкачественные и злокачественные костные опухоли, миеломная болезнь, лимфогранулематоз с поражением костей, деформирующее поражение кости при болезни Педжета – активность фермента выше нормы в 20 раз и более), при заболеваниях печени с явлениями холестаза (механическая желтуха – повышение в 5‑10 раз, холангит, холангиолит, цирроз печени, острая жёлтая дистрофия печени и др.), при заболеваниях почек рост активности щелочной фосфатазы связан с нарушением метаболизма витамина D, вторичным гиперпаратиреозом.
|
|
|
Определение активности фермента в ротовой жидкости
Щелочную фосфатазу секретирует подъязычная железа, фермент может иметь лейкоцитарное и бактериальное происхождение, хорошо работает в нейтральной среде, но оптимум рН 9,1‑10,5. Фермент участвует в минерализации и реминерализации эмали, обеспечивая образование и поступление неорганического фосфата HPO42– в ткани зуба. Активность щелочной фосфатазы слюны коррелирует с минерализующей активностью ротовой жидкости. Здесь также присутствует несколько изоферментов кислой фосфатазы, секретируемых околоушными железами, однако они проявляют максимальную активность в более кислой среде (оптимум рН 4,8) при скоплении микроорганизмов в полости рта.
Проведение анализа
| Опыт, мкл | Контроль, мкл | |||
| Субстратно-буферный раствор | 1000 | 1000 | ||
| Инкубируют 5 мин при 37ºС | ||||
| Ротовая жидкость | 100 | – | ||
| Перемешивают, инкубируют 30 мин при 37ºС и останавливают реакцию | ||||
| Раствор едкого натра | 4000 | 4000 | ||
| Стандартный раствор | – | 100 | ||
| Колориметрируют опытную пробу против контроля при длине волны 405 нм (сине-фиолетовый светофильтр) в кювете 10 мм.
| ||||
Расчёт
Содержание пара‑нитрофенола (мкмоль) в опытной пробе находят по прилагаемому калибровочному графику. Активность щелочной фосфатазы рассчитывают по формуле, выражая в микромолях пара‑нитрофенола, освободившегося под влиянием 1 мл слюны за 1 час инкубации при 37 ºС.
Активность ЩФ [мкмоль/(мл · ч)] = 
,
где А ‑ содержание пара-нитрофенола в пробе, найденное по калибровочному графику (мкмоль); 0,1 ‑ коэффициент пересчёта на 1 мл слюны; 2 ‑ коэффициент пересчёта на 1 час инкубации.
Практическое значение
Щелочная фосфатаза слюны участвует в минерализации и реминерализации эмали, обеспечивая образование неорганического фосфата (НРО4)2‑. Активность фермента повышается при воспалении мягких тканей полости рта, пародонтите, у лиц с металлическими зубными протезами из нержавеющей стали.
Оформление работы
Указывают принцип метода, фиксируют результаты, делают расчёты и выводы о наличии/отсутствии патологических отклонений, описывают клиническое значение.
Лабораторная работа 5.
Оценка проницаемости зубной эмали
Актуальность
Эмаль зуба имеет свойства полупроницаемой мембраны, проницаемость которой зависит от физико-химических особенностей среды, окружающей зуб. Между эмалью и ротовой жидкостью идёт ионный обмен. В нормальных условиях в результате этого процесса, который, начинается в момент прорезывания зуба и продолжается всю жизнь, происходит минерализация («созревание») эмали, вследствие чего значительно снижается её проницаемость. рН среды и деминерализация – очень важные взаимосвязанные факторы, влияющие на проницаемость эмали. Зубной налёт увеличивает проницаемость эмали. В ротовой полости идут два противоположно направленных процесса: накопление кислых продуктов в ходе ферментации углеводов и накопление щелочных продуктов вследствие утилизации азотосодержащих веществ. Проницаемость эмали возрастает, главным образом, за счёт органических кислот, образующихся из углеводов микрофлорой зубного налёта и скапливающихся под бляшками на поверхности зуба. При увеличении содержания кислот ионы водорода проникают внутрь кристаллов гидроксиапатита, обмениваясь на выходящий из эмали Са2+. Органические кислоты ‑ одна из причин деминерализации при кариесе и некариозных поражениях твердых тканей зуба.
|
|
|
Принцип метода
Зубная эмаль окрашивается метиленовым синим в силу способности избирательно пропускать разные вещества. По интенсивности окраски судят об изменении проницаемости эмали под действием кислот, щелочей.
|
|
|
Реактивы
1) 10 % раствор НСl, 2) 10 % раствор NаОН, 3) 1 % раствор метиленовой сини.
Материал для исследования
Зубы (с целой эмалью) человека или животного.
Проведение анализа
Выбирают три приблизительно одинаковых участка на поверхности эмали зуба, обводят простым карандашом и обрабатывают с помощью маленьких ватных тампонов, смоченных соответствующим реактивом: первый участок ‑ 10 % раствором соляной кислоты, второй ‑ 10 % раствором NаОН, третий (контрольный) ‑ дистиллированной водой (важно!: тампоны не должны соприкасаться). Время экспозиции ‑ 20 мин. Эмаль просушивают и 3 минуты обрабатывают 1 % раствором метиленовой сини, используя пинцет с ватным тампоном. Подсушивают и наблюдают различную интенсивность окрашивания изучаемых участков эмали зуба.
Практическое значение
Под влиянием кислот, образующихся при ферментации простых углеводов микрофлорой зубного налёта, нарушается ионный обмен эмали, повышается её растворимость и проницаемость для различных групп веществ, что сопровождается активацией деминерализации, развитием кариеса, разрушением зуба.
В стоматологической практике в случае некариозных поражений твердых тканей зуба при обследовании больного используется ряд дополнительных методов, одним из которых является витальное окрашивание эмали (5 % спиртовой настойкой йода, 2 % раствором метиленовой сини). На основе результатов теста подсчитывают индекс реминерализации для оценки степени минерализации твердых тканей зуба.
Методика проведения теста. Очищенную от зубного налёта и высушенную поверхность некариозного поражения или пятна смазывают 5% настойкой йода, который проникает в ткани зуба при снижении их минерализации, окрашивая очаг поражения в жёлто-коричневый цвет. Степень окрашивания оценивают сразу же, поскольку йод очень летуч и быстро испаряется.
Коды оценки результатов теста: 1 – отсутствие окрашивания, 2 – светло-жёлтое окрашивание, 3 – от тёмно-жёлтого до светло-коричневого окрашивания, 4 – тёмно-коричневое окрашивание.
Расчёт индекса реминерализации (ИР) производят по формулe:
Критерии диагностики по результатам теста (в баллах):
1 ‑ преобладают процессы реминерализации,
2 ‑ имеются процессы реминерализации,
3 ‑ имеются процессы деминерализации,
4 ‑ преобладают процессы деминерализации.
Примечание. К некариозным поражениям, которые возникают до прорезывания зубов, относят гипо- или гиперплазию эмали и дентина, эндемический флюороз зубов, наследственные нарушения развития твёрдых тканей зуба, медикаментозные и токсические нарушения развития тканей зуба. К некариозным поражениям, возникающим после прорезывания зубов, относят пигментации (дисколориты) зубов, налёты на зубах, клиновидный дефект, эрозию или некроз эмали, медикаментозные и токсические нарушения развития тканей зуба, гиперестезию эмали и дентина, стираемость твёрдых тканей зуба, травму зуба.
Оформление работы
Указывают принцип метода, сравнивают полученные результаты. Делают вывод о влиянии кислот и щелочей на проницаемость эмали.
Лабораторная работа 7.
Определение концентрации фторидов в питьевой воде
Актуальность
Недостаточное содержание фторидов в водопроводной воде приводит к нехватке фтора в организме. Результатом недостатка фтора в слюне становится уменьшение включения ионов F– в кристаллы апатитов эмали, что снижает её микротвёрдость и кислотоустойчивость. Поступление малых количеств фтора в поверхностные слои эмали необходимо для формирования кристаллов гидроксифторапатита и фторапатита:
Са10(РО4)6(ОН)2 + F– → Са10(РО4)6(ОН)F +(ОН)–
Са10(РО4)6(ОН)2 + 2F– → Са10(РО4)6F2 +2(ОН)–
Ионы F– среди всех прочих ионов имеют максимальную способность к замещению ионов ОН– в апатитах в силу того, что у них очень близки ионные радиусы, одинаковы заряд и степень гидратации. Облегчает подобный обмен способность ионов фтора легко диффундировать в гидратный слой кристаллов гидроксиапатитов и обратно. Именно этот слой содержит мобильные запасы фтора – до 15 %. Хотя дальнейшее проникновение ионов фтора во внутренние слои кристаллической решётки происходит гораздо медленнее, возврат оттуда в гидратную оболочку и далее наружу затруднён ещё больше. Повышенная прочность фторапатитов обусловлена свойствами ионов фтора: они связаны с кристаллической решёткой крепче ионов ОН–, препятствуют диффузии Н+ внутрь эмали, ограничивают выход ионов Са2+ и РО42‑ из кристалла наружу.
Тотального изоморфного замещения ионов ОН– ионами F– в кристаллической решётке апатитов не происходит. Фторсодержащих апатитов в эмали в норме около 0,4‑0,66 %, они более резистентны к растворению в кислой среде, чем гидроксиапатиты. При замещении фтором даже 1 из 50 гидроксильных групп растворимость эмали резко понижается. Такие замены повышают кариесорезистентность эмали и относятся к протекторным, с ними связано профилактическое действие малых концентраций фтора. Уровень фтора в эмали постоянных зубов по отношению к молочным растёт с увеличением концентрации F– в воде.
Принцип метода
Метод основан на образовании растворимого в воде тройного комплекса сиренево-синего цвета, в состав которого входит лантан, ализарин-комплексон и фторид, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации фторидов в воде. Для повышения оперативности измерения оптической плотности определение проводят в водно-ацетоновой среде, в которой полнота развития окраски тройного комплекса достигается через 15 мин. Алюминий и железо сильно мешают определению фторидов, связывая их в комплекс и занижая результаты. Допустимая массовая концентрация алюминия не выше 0,2 мг/л, железа — не выше 0,7 мг/л. Фотометрический метод с лантан-ализарин комплексоном в водно-ацетоновой среде используют для оценки количества фторидов в воде при их содержании в диапазоне концентраций 0,04‑0,60 мг/л.
Реактивы
1) Раствор 1 (0,1 М ацетатный буфер (рН 7,4) и азотнокислый лантан, соотношение 1:5), 2) раствор 2 (ализарин комплексон и ацетон, соотношение 6,5:11), 3) рабочий раствор (ex tempore: смесь 6,4 мл раствора 1 и 18,6 мл раствора 2).
Калибровочный график на фториды лаборанты готовят заранее.
Материал для исследования
Пробы водопроводной воды.
Проведение анализа
Отбор пробы воды. Объём пробы воды для двух параллельных определений должен быть не менее 100 мл. Пробу отбирают в полиэтиленовую посуду и не консервируют. При необходимости пробу хранят в холодильнике и анализируют не позднее чем через 3 суток.
Анализ проб воды. В мерную колбу на 50 мл помещают 25 мл анализируемой воды (если массовая концентрация фторидов больше 0,6 мг/л, то берут 10,0 мл или меньший объём, доводят его до 25 мл), приливают 25 мл рабочего раствора (до метки), перемешивают, инкубируют 15 мин. Колориметрируют в диапазоне длин волн 590‑610 нм в кювете 50 мм относительно контроля (рабочий раствор). Массовую концентрацию фторидов в воде находят по калибровочному графику и выражают в мг/л. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.
Нормальные величины
Оптимальное содержание фторидов в питьевой воде 0,5‑1,0 мг/л.
Практическое значение
Содержание фторидов в питьевой воде играет одну из главных ролей в распространённости кариеса среди населения. Потребление питьевой воды, где фторидов менее 0,5 мг/л, приводит к высокому уровню поражения зубов кариесом у всех групп населения. Одним из методов профилактики и снижения заболеваемости кариесом является фторирование источников питьевой воды, что особенно актуально в регионах с низким содержанием фторидов в воде и окружающей среде в целом. Наряду с фторированием воды полезным способом профилактики кариеса является применение F-содержащих зубных паст.
Оформление работы
Указывают принцип метода, фиксируют данные, производят расчёты по прилагаемому калибровочному графику, сравнивают результат с оптимальными значениями, делают выводы.
Лабораторная работа 8.
Влияние сахарозы на содержание лактата в зубном налёте
Актуальность
Содержание лактата в зубном налёте является одним из показателей, используемых для качественной оценки возможности формирования кариесогенной ситуации в полости рта. Микрофлора зубного налёта избирательно поглощает сахарозу пищевых продуктов и гидролизует её на глюкозу и фруктозу. Анаэробная микрофлора зубного налёта утилизирует полученные моносахариды по пути гликолиза с образованием лактата. Лактат снижает рН слюны и зубного налёта, что нарушает в зубной эмали баланс между минерализацией и деминерализацией в пользу последней. Кариесогенности зубного налёта способствуют: наличие анаэробных микроорганизмов, повышенное употребление углеводов, высокая скорость образования бляшек.
Цель работы
Подтвердить, что употребление сладостей (лёгких углеводов) в перерывах между лекциями, на занятиях небезопасно для нормального состояния зубов.
Принцип метода
Определение уровня лактата основано на реакции Уффельмана. В которой фенолят железа фиолетового цвета преобразуется в лактат железа жёлтого цвета (интенсивность окраски от слабо жёлтой до ярко жёлтой отмечают: +, ++, +++).
Реактивы
1) 1% раствор фенола, 2) 1% раствор FeCl3, 3) 1% раствор лактата.
Леденцы или сахар-рафинад, жевательная резинка («Орбит» или другая).
Материал для исследования
Зубной налёт (для получения хорошего результата испытуемым студентам необходимо не чистить зубы утром в день занятия и накануне вечером, почистить зубы рекомендуется по окончании лабораторной работы).
Проведение анализа
1) У 2-х студентов снимают зубной налёт со щёчной поверхности маляров ватным тампоном на палочке, тампоны помещают в пробирки (№1 и №2) с 0,5 мл дистиллированной воды. В пробирку №3 с 0,5 мл дистиллированной воды помещают 1 каплю раствора лактата (контроль реакции).
Цветная реакция на лактат. В отдельной пробирке из 2,0 мл раствора фенола и 3 капель раствора FeCl3 готовят раствор фенолята железа фиолетового цвета. Смесь добавляют по 0,6 мл в пробирки №1, №2, №3, оценивают развитие окраски. При отсутствии лактата жидкость обесцвечивается, при его наличии фиолетовая окраска сменяется зеленовато-жёлтой вследствие образования лактата железа.
2) Студент со слабо выраженной окраской (+) пробы на лактат употребляет леденцы на основе сахарозы или сахар-рафинад (медленно рассасывая).
Студент с более ярко выраженной окраской (++, +++) пробы на лактат 10‑15 минут использует жевательную резинку («орбит» или другую, в составе которой сахарозаменители сорбит, аспартам и иные компоненты, но нет сахарозы).
Через 15‑20 минут от начала использования студентами леденцов или жевательной резинки проводят повторное получение зубного налёта и оценку наличия в нём лактата.
Наглядность результатов работы
Увеличение образования лактата в зубном налёте после употребления конфет: фиолетовая окраска исходного раствора фенолята железа в реакции Уффельмана сменилась на выраженную жёлтую после добавления раствора, содержащего повторно снятый зубной налёт.
Снижение образования лактата в зубном налёте после жевания резинки «Орбит» или другой: выраженное жёлтое окрашивание не появилось, сохранилась фиолетовая окраска.
Практическое значение
Полученные результаты подтверждают обоснованность мероприятий, рекомендуемых для профилактики кариесогенной ситуации: механическая очистка зубов и полости рта; снижение потребления сладкого и повышение употребления овощей и фруктов; отказ от сладкого между приемами пищи и перед сном; уменьшение употребления продуктов, содержащих кислоты (соления, маринады); использование вспомогательных антикариозных средств (жевательные резинки, жидкости для полоскания рта и др.).
В клинической практике желательно учитывать состояние организма, иммунологический статус, перенесённые в детстве заболевания, региональные факторы питания (недостаток фтора и других макро- и микроэлементов в пище), индивидуальный уровень резистентности к кариесу.
Оформление работы
Указывают принцип метода, фиксируют результаты, делают выводы.
Лабораторная работа 6.
Определение влияния рН среды на состояние тканей зуба
Актуальность
Кислоты способны вымывать ионы кальция из тканей зуба, провоцируя сначала обеднение кристаллов гидроксиапатита кальцием и затем постепенное их разрушение.
Принцип метода
В кислой среде ионы кальция Cа2+ замещаются на протоны Н+ по схеме:
Са10(РО4)6(ОН)2 + 2Н+ → Са9Н2(РО4)6(ОН)2 + Cа2+
В итоге кислотная нагрузка ведёт к разрушению/растворению кристаллов.
Реактивы
1) Кислые растворы (лактат с добавлением HCl) рН=5 и рН=6, 2) раствор с нейтральным значением рН=7, 3) слабощелочной раствор (карбонатный) рН=8, 4) реактивы для определения содержания кальция (лабораторная работа 2).
Материал для исследования
Зубы с целой эмалью человека/животного, пластинки срезов зуба, слюна.
Проведение анализа
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 117; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!