Проба с цетилтриметиламмониумбромидом
Принцип метода
Гликозаминогликаны при взаимодействии с цетилтриметиламмониумбромидом формируют преципитат, интенсивность образования и осаждения которого зависит от их содержания в исследуемой пробе мочи.
Ход работы
К 5,0 мл свежей мочи прибавляют 1,0 мл 2,5 % раствора цетилтриметиламмониумбромида, инкубируют в течение 30 мин, наблюдая за образованием преципитата. Пробу ставят при комнатной температуре.
Оценка результатов
Пробу оценивают по шкале от 0 до 4+ в соответствии с интенсивностью образования преципитата и характером осадка. Проба даёт до 40 % ложноположительных результатов.
Проба с толуидиновым синим
Принцип метода
Гликозамингликаны, при появлении их в моче, способны взаимодействовать с красителем толуидиновым синим, образуя соединение пурпурной окраски.
Ход работы
Одну каплю мочи наносят на бумагу, высушивают при комнатной температуре. Бумагу помещают в раствор толуидинового синего на 1 мин, затем обесцвечивают фон, погружая лист в 10 % раствор уксусной кислоты. Контроль (раствор хондроитинсульфата А (2 мг/мл) или моча больного мукополисахаридозом) обрабатывают параллельно опытной пробе.
Оценка результатов
Реакция положительна при развитии пурпурной окраски и может свидетельствовать о наличии гликозаминогликанов в моче.
Клинико-диагностическое значение
Проба с ЦТАБ положительна при мукополисахаридозах (особенно выражена у детей с синдромами Гунтера, Гурлера), синдроме Марфана, множественных экзостозах, ревматоидном артрите, кретинизме, карциноматозе. Проба с толуидиновым синим чувствительнее, чем проба с ЦТАБ, поэтому её целесообразно использовать для анализа всех «положительных» образцов, образующих с ЦТАБ осаждающийся преципитат.
|
|
|
Оформление работы
Указывают принципы методов, регистрируют результаты, сравнивают их и делают вывод о наличии/отсутствии патологических отклонений.
Лабораторная работа 3.
Оценка содержания гексоз гликопротеинов в сыворотке крови
Актуальность
Гликопротеины межклеточного матрикса имеют ковалентно присоединённые углеводные цепи гораздо меньшей длины, чем у протеогликанов. Моносахаридные остатки в составе олигосахаридных фрагментов гликопротеинов относятся к гексозам, в том числе присутствуют дезокси- и аминогексозы. Из гликопротеинов соединительной ткани выделены N‑ацетилгалактозамин и N‑ацетилглюкозамин. Во время синтеза N‑связанных гликопротеинов обычно обнаруживают глюкозу, но в зрелых гликопротеинах она отсутствует. Характерным сахаром N‑связанных гликопротеинов является манноза. В концевых отделах гликопротеинов встречается фукоза, но наиболее частым терминальным сахаром считают N‑ацетилнейраминовую кислоту, субтерминально к ней нередко расположена галактоза, которую также выделяют из состава кóрового олигосахарида протеогликанов.
|
|
|
Гексозы важны для проявления структурных, соединительных, защитных, иммунных, регуляторных свойств гликопротеинов.
Принцип метода
Гликопротеины благодаря содержащимся в них гексозам проявляют способность осаждаться из сыворотки крови при действии 96% этанола. Освобождённые в результате последующего гидролиза гексозы взаимодействуют с орциновым реактивом, окрашивая раствор в жёлто-оранжевый цвет, интенсивность которого пропорциональна содержанию гексоз.
Реактивы
1) Этанол 96°, 2) 0,1 М раствор NaOH, 3) орциновый реактив, 4) стандартный раствор гексоз (1 г/л).
Материал для исследования
Сыворотка крови.
Ход работы
Готовят три пробы: опытную, стандартную и контрольную.
Опытная проба ‑ в центрифужную пробирку помещают 0,1 мл сыворотки крови и 2,5 мл этанола, перемешивают путем встряхивания, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирку осторожно опрокидывают на 30‑60 сек на фильтровальную бумагу. Оставшийся в пробирке белковый осадок растворяют, добавляя 0,5 мл 0,1 М раствора NaOH. Затем осторожно(!) доливают 4,5 мл орцинового реактива и тщательно перемешивают стеклянной палочкой.
|
|
|
Стандартную пробу готовят, добавляя к 0,1 мл стандартного раствора (1 г/л) гексоз 0,4 мл 0,1 М раствора NaOH и 4,5 мл орцинового реактива.
Контрольную пробу готовят путём добавления к 0,5 мл 0,1 М раствора NaOH 4,5 мл орцинового реактива.
Все пробирки помещают в кипящую водяную баню на 15 мин, охлаждают под проточной водой. Опыт и стандарт фотометрируют против контроля в диапазоне длин волн 500‑560 нм (зелёный светофильтр) в кювете 10 мм.
Расчёт
Для расчёта результатов используют формулу:
,
где: СОП ‑ концентрация в крови гексоз гликопротеинов (г/л),
ССТ ‑ концентрация гексоз в стандартном растворе (г/л),
ЕОП и ЕСТ ‑ экстинкции опытной и стандартной проб.
Нормальные величины
Концентрация гексоз гликопротеинов в сыворотке крови ‑ 1,05‑1,15 г/л.
Клинико-диагностическое значение работы
Традиционно полагают, что увеличение уровня гликопротеинов (гексоз гликопротеинов) в крови отражает лишь процессы деструкции соединительных тканей при патологических процессах воспалительного и иного характера. Однако, как выяснилось, в ответ на повреждения печень усиленно синтезирует гликопротеины, многие из которых участвуют в репарации. Обладая биологически активными группами (например, сиаловыми кислотами, способными инактивировать ряд биологических агентов), гликопротеины проявляют защитные функции, направленные на ограничение патологического процесса (компенсаторная реакция).
|
|
|
Оформление работы
Указывают принцип метода, фиксируют показания прибора, производят расчёты, сравнивают нормальные величины с полученными данными, делают вывод о наличии/отсутствии патологических отклонений.
Лабораторная работа 4.
Определение количества сиаловых кислот в сыворотке крови
Сиаловые кислоты или N-ацетилнейраминовые кислоты играют важную роль в качестве строительных блоков гетерополисахаридов, входящих в состав гликопротеинов и гликолипидов. Сиаловые кислоты обычно являются концевыми остатками полисахаридных цепей гликопротеинов и гликолипидов. Гликолипиды встречаются в мембранах, главным образом, в плазматической. Гликопротеины содержатся в мембранах, цитозоле, жидкостях организма. Сиаловая кислота синтезируется из фосфоенолпирувата и N‑ацетилманнозамина‑6‑фосфата. В сыворотке крови определяют только связанные сиаловые кислоты.
Принцип
При добавлении трихлоруксусной кислоты к сыворотке крови идет мягкий гидролиз с отщеплением сиаловых кислот от сиалогликопротеинов. Сиаловые кислоты при нагревании с уксусно-сернокислым реактивом дают буровато-розовую окраску, интенсивность которой пропорциональна их концентрации.
Материал для исследования
Сыворотка крови.
Реактивы
1) 10 % раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), 2) уксусно-сернокислый реактив (реактив Гесса), 3) стандартный раствор сиаловых кислот (1 г/л).
Проведение анализа
Опытная проба. Для выделения сиаловых кислот в центрифужную пробирку вносят 1 мл сыворотки крови, 1 мл раствора ТХУ, перемешивают, закрывают фольгой, помещают точно на 5 мин в кипящую водяную баню для гидролиза гликопротеинов, охлаждают, центрифугируют 3‑5 мин при 1500 об/мин (или фильтруют через смоченный водой бумажный фильтр). Для проведения реакции на сиаловые кислоты переносят 0,4 мл надосадочной жидкости (фильтрата) в чистую пробирку, добавляют 5 мл реактива Гесса, закрывают фольгой, кипятят 15‑20 мин (появляется буровато-розовая окраска), охлаждают.
Стандартная проба. Берут 0,4 мл стандартного раствора сиаловых кислот, обрабатывают с 5 мл реактива Гесса аналогично опыту.
Интенсивность окраски обеих проб измеряют на колориметре против реактива Гесса, длина волны 540 нм (зелёный светофильтр), кювета 1 см.
Расчёт
При отсутствии стандартного раствора содержание сиаловых кислот в сыворотке крови можно выражать в условных единицах, для чего полученную величину экстинкции опытной пробы умножают на 1000. При наличии стандартного раствора расчёт результатов проводят по формуле:
,
где: СОП — концентрация в крови сиаловых кислот гликопротеинов (г/л),
ССТ — концентрация сиаловых кислот в стандартном растворе (г/л),
ЕОП и ЕСТ — экстинкции опытной и стандартной пробы.
Нормальные величины
Сыворотка крови 135‑200 усл.единиц
или 2,0‑2,36 ммоль/л
или 0,62‑0,73 г/л
Практическое значение
Концентрация сиаловых кислот в крови повышается при воспалениях (эндокардит, остеомиелит), туберкулезе, лейкемии, нефрозе, лимфогранулематозе, поражении гепатоцитов, деструкции соединительной ткани (коллагенозы и др.), резко растет при опухоли головного мозга, инфаркте миокарда. Снижение уровня сиаловых кислот ‑ при пернициозной анемии, гемохроматозе, болезни Вильсона и дегенеративных процессах в ЦНС.
Оформление работы
Указывают принцип метода, записывают результаты измереня, производят расчёт, сравнивают нормальные величины с полученными данными, делают вывод о наличии или отсутствии патологических отклонений.
Вопросы для самоконтроля
1) Типы соединительных тканей, их морфофункциональные особенности. Межклеточный матрикс, химический состав, роль в организме.
2) Фибриллярные белки. Специфика аминокислотного состава и структуры коллагена, синтез, посттрансляционная модификация и ферменты, фолдинг, созревание, распад. Роль аскорбата в синтезе. Типы и группы коллагена, функции, роль в минерализации.
3) Особенности строения и функций эластина, эластин и коллаген. Адгезивные и антиадгезивные белки внеклеточного матрикса, строение и функции, роль в межклеточных взаимодействиях. Сахара гликопротеинов (гексозы и сиаловые кислоты).
4) Протеогликаны матрикса, классы, роль, синтез и распад. Строение углеводного кора, гликозаминогликанов. Сборка надмолекулярных комплексов.
5) Коллагеновые болезни, мукополисахаридозы и другие патологии соединительной ткани. Матриксные металлопротеиназы, гликозидазы.
6) Пульпа – вариант специализированной соединительной ткани, состав, свойства, функции.
ТЕМА 10.2.
Костная ткань. Твёрдые ткани зуба. Минерализация
Актуальность
Костная ткань и большинство тканей зуба относятся к плотной оформленной соединительной ткани. Альвеолярный отросток челюстной кости ‑ часть скелета и подчиняется метаболическим закономерностям костной ткани. Особое место среди минерализованных тканей занимает эмаль в связи со спецификой происхождения, состава и функций. Межклеточное вещество специализированных видов соединительной ткани определяет их основные свойства. Важную функцию выполняют кальций-связывающие и адгезивные белки. Расположение нитей коллагена в матриксе твердых тканей обеспечивает выполнение главных функций этого белка ‑ придавать тканям прочность на разрыв и обеспечивать минерализацию костей, зубного дентина, цемента и периодонтальной связки. Помимо органических веществ твердые ткани характеризуются высоким содержанием минералов, среди которых преобладают фосфорнокислые соли кальция в виде апатитов. Образование и распад минеральной фазы твёрдых тканей организма тесно связаны с индивидуальным обменом кальция, фосфора, других макро- и микроэлементов. Наиболее значимым микроэлементом, повышающим устойчивость апатитов, является фтор. Зубы ‑ специализированный орган, где прямо соприкасаются закономерности «поведения» органических и минеральных веществ. Понимание взаимоотношений между обменом органических компонентов и минералов в тканях зуба далеко от совершенства, на что указывают нерешённые проблемы борьбы с кариесом, воспалительными и иными заболеваниями полости рта.
Цель
1. Сформировать представление о химическом составе костной ткани и тканей зуба, о зависимости характеристик кристаллов гидроксиапатита от состояния минерального обмена в организме.
2. Освоить методы выявления основных неорганических веществ и белка в костной и зубных тканях, оценки концентрации кальция и фосфатов в плазме крови и моче, фторидов в воде.
3. Оценить проницаемость эмали зуба, акцентировать внимание на роли фтора в поддержании здоровья эмали зубов.
Вопросы для самоподготовки
1) Происхождение, состав, построение, функциональная организация костной ткани. Сходство и различия кости, соединительной и хрящевой тканей.
2) Комплексы протеогликанов матрикса кости, фибриллярные белки и гликопротеины различной природы. Коллагены и специфичные для костной ткани матриксные белки, посттрансляционная модификация, назначение, функции.
3) Механизмы моделирования и ремоделирования кости, роль ферментов и простагландинов, особенности процессов в альвеолярном отростке челюстной кости. Влияние пирофосфата и бифосфонатов на резорбцию кости.
4) Регуляция метаболизма костной и зубных тканей с участием витаминов (А, С, К, D), гормонов (паратгормон, кальцитонин, глюкокортикоиды, половые, тиреоидные и др.), белковых факторов (морфогены, митогены, факторы хемотаксиса и хемоаттракции, кейлоны).
5) Рахит (ранние и поздние проявления). Остеомаляция. Остеопороз и его виды. Причины появления, сходство и различия заболеваний.
6) Происхождение, функциональная организация и взаимосвязи тканей зуба.
7) Сходство и различия кости и зубного цемента. Виды цемента, роль, химический состав, специфические белки, возможности регенерации.
8) Химический состав и функции дентина. Виды дентина (плащевой, интертубулярный и перитубулярный), происхождение, функции, особенности минерализации. Сходство и различия первичного, вторичного и третичного дентина. Дентинные канальцы. Дентинная жидкость: состав, происхождение, значение для тканей зуба.
9) Химический состав зубной эмали. Эмбриональная эмаль: синтез, созревание, значение наносфер, участие белков и ферментов в разные фазы образования эмали. Белки зрелой эмали. Факторы, влияющие на устойчивость и проницаемость эмали. Эмалевая жидкость.
10) Коллаген, неколлагеновые белки кости и зуба, роль в минерализации. Роль органических молекул (фосфолипидов, цитрата и др.) в накоплении Са, появлении первичных кристаллов в ходе минерализации. Щелочная фосфатаза.
11) Теории минерализации кости и твёрдых тканей зуба. Гомогенная и гетерогенная нуклеация. Роль клеток в накоплении минералов и минерализации, матриксные пузырьки. Факторы, влияющие на процессы кристаллизации.
12) Кальций и фосфат межклеточного матрикса, функции, обмен. Фосфаты кальция ‑ основа минеральной фазы (витлокит, монетит, брушит; ди-, три-, тетракальцийфосфаты, октакальцийфосфат, апатиты). Магний в организме, участие в минеральной фазе (струвит, невберит, апатит) твёрдых тканей.
13) Минеральные компоненты аморфной фазы твердых тканей, этапы преобразования в ГАП. Типы кристаллов. Сравнение кристаллов ГАП кости и тканей зуба. Механизм формирования кристаллов ГАП в эмали.
14) Условия образования вакансий, этапы изоморфного замещения элементов кристаллической решетки, роль в модификации апатитов. Механизмы и реакции поступления, последствия включения макро- и микроэлементов в кристаллы ГАП кости и твёрдых тканей зуба. Рахитоподобные состояния, «уровская болезнь» (Кашина-Бека) и другие патологии.
15) Фтор, роль в процессах жизнедеятельности. Источники фтора и потребность в нём. Влияние фтора на ткани зуба. Гипофтороз, флюороз зубов.
16) Поверхностные образования на зубах (кутикула, пелликула, зубной налёт): состав, механизмы образования. Роль микрофлоры в синтезе стромы налёта (декстраны, леваны, маннаны и др.), углеводно-фосфорный обмен в бляшке. Минерализации зубной бляшки, разнообразие минералов зубного камня.
17) Кариес. Причины, механизмы развития, профилактика. Особенности биохимических нарушений в разных тканях зуба.
18) Состояние зубов и питание: углеводы, белки, витамины и микроэлементы.
Лабораторная работа 1.
Обнаружение белка и минеральных компонентов
в костной ткани и тканях зуба
Костная ткань и ткани зуба – это варианты плотной оформленной соединительной ткани. Межклеточный матрикс минерализованных тканей содержит белки и сульфатированные гликозаминогликаны. Главный белок кости, дентина и цемента зуба – коллаген, также представлены адгезивные и антиадгезивные гликопротеины и Са-связывающие белки. Зубная эмаль содержит специфичные белки, нерастворимые в ЭДТА и НСl ‑ производные эмбриональных энамелинов и амелобластинов. Для поддержания структурно-функционального статуса кости и зуба важна минеральная фаза, распределенная в органической в виде тончайших включений. Их отличает высокая концентрация минералов (фосфаты Са и Mg, карбонаты Са, фторид Са и др.), в основном это кристаллы ГАП.
Материал для исследования
1) Минерализаты кости, тканей зуба (готовят лаборанты: 5 г порошка кость/зуб инкубируют с 25 мл 0,5 % раствора Н2SО4 в течение суток, отфильтровывают), 2) гидролизаты кости и тканей зуба (готовят студенты на занятии).
Реактивы
1) Молибденовый реактив, 2) 10 % раствор уксусной кислоты, 3) насыщенный раствор щавелевокислого аммония, 4) 10 % раствор НСl, 5) 5 % раствор ВаСl2, 6) 10 % раствор NaOН, 7) 1‑2% раствор СuSО4.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 207; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!