ИНДИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ  ДРОЖЖЕЙ

При установлении причин порчи продукта необ­ходимо поставить вопрос, являются ли наблюдаемые изменения следствием раз­множения микроорганизмов, изменений в рецептуре или условий хранения. При высокой степени порчи продукта микроорганизмы, ее вызвавшие, могут быть об­наружены обычной микроскопией при 400-500-кратном увеличении. Дрожжи при микроскопии окрашивают кристаллическим фиолетовым. Для этого ма­ленькую каплю 0,5%-ного кристаллического фиолетового вносят в продукт непосредственно на предметном стекле или смешивают с небольшим количеством продукта, разбавленным дистиллированной водой (1 : 10). Микроскопи­ческое исследование позволяет идентифицировать микроорганизм, вызвавший его порчу.

Индикацию дрожжей из испорченных пищевых продуктов осуществляют методом посева на разные питательные среды. Рекомендуется использо­вать среду па основе дихлорана бенгальского розового агара с хлорамфениколом (DBRC) как длявыделения плесеней, так и дрожжей. Среда ограничивает рост колоний плесеней, позволяя произвести более точный подсчет колоний. ДВПП обычно хорошо размножаются при +25 °С на стандартном солодово-дрожжевом агаре (3 г дрожжевого экстракта, 3 г солодового экстрак­та, 5 г пептона, 10 г глюкозы, 20 г агара, 1 л воды, рН 5-7). Эту среду используют как для обнаружения, так и количественного определения стан­дартным методом чашечного подсчета. Необходимо растворить образец в 0,1%-пом пептопном бульоне.Значе­ние рН солодово-дрожжевого агара близко к нейтральному, поэтому рН среды доводят до 4,5 с помощью раствора соляной кислоты.

При анализе пищевых продуктов микробиологи широко используют МЕА (агар на солодовом экстракте) и TGY (агар на триптонотлюкозном дрожжевом экстракте), причем последний более предпочтителен. Ускоренное обнаружение дрожжей, стойких к кон­сервантам (Z. bailii и Z. bisporus), проводят на подкисленной МЕА (напри­мер, МАА, уксуснокислый солодовый агар) или подкисленной TGY(TGYA). В основную питательную среду (МЕА или TGY) добав­ляют 0,5% уксусной кислоты. Колонии дрожжей обычно становятся различимыми через 3-7 сут. Колонии могут быть представлены более чем одним видом дрожжей (из-за сходства внешнего вида колоний это может быть сначала незаметно). При попытке индикации Zygosaccharomyces (напри­мер, Z. bailii) и других видов дрожжей время, необходимое для их обна­ружения в продукте, можно сократить путем инкубирования чашек с агаром при 30 °С вместо 25 °С. Следует учитывать, что некоторые виды дрожжей осмофильны (в частно­сти, Z. bailii, Z. bisporus, Z. rouxii), поэтому для посева можно использовать высокоосмо­тические питательные среды на основе YM или TGYe добавлением 40% глюкозы. Разведенный образец окажется также высокоосмотичным (напри­мер, 0,1%-ный пептонный бульон с 40% глюкозы).

Для обнаружения отдельных видов Zygosaccharomyces и других дрожжей разработан ряд специальных культуральных сред с различной эффективностью. К ним относится, в частности, лизиноный агар, применяемый для различе­ния видов дрожжей-несахромицетов в тех случаях, когда они встречаются вместе с Saccharomyces cerevisiae, поскольку последние не утилизируют лизин как источ­ник азота. Из охлажденных приправ были случайно выделены психрофильные виды Mrakia и Rhodosporidium, в связи с чем возможна порчапищевых продуктов при низких температурах. Для выделения указанных видов дрожжей может пона­добиться инкубация образцов таких пищевых продуктов при температуре 5-10 °С.

Таким образом, основным способом обнаружения ДВПП является посев проб и ожидание проявления видимых признаков размножения микроорганизмов.

Метод не лишен недостатков, главный из которых–затраты времени. Метод измерения импеданса основан на свойстве микроорганизмов при размно­жении изменять электропроводность питательной среды. Этот метод был использован для обнаружения дрожжей, вызывающих порчу вина. В качестве метода оценки концентрации микроорганизмов в пищевых продуктах и напитках применяется также измерение АТФ-биолюминесценции, так как АТФ содержится во всех живых клетках. С его помощью невозможно идентифи­цировать отдельные их виды. При анализе напитков имеется другая возможность – продукт пропускают через мембранный фильтр. После чего прово­дится окрашивание клеток и их подсчет под микроскопом. Разработано несколько методов, основанных па анализе ДНК и позволяющих проводить ускоренное обнаружение и количественную оценку микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых продуктов.

 

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ

 

К методам идентификации дрожжей относят выявление морфологии клетки, определение способов формирования пло­довых образований, способов сбраживания углеводов и утилизации азот- и углеродсодержащих соединений. Постоянно встает вопрос, насколько точны традиционные методы идентификации видов. Кстати, виды дрожжей, описанные до 1980 г., были идентифицированы традиционными фенотипическими методами. При сравнении с результатами идентификации на молекулярном уровне правильными оказались более половины из них. В ходе недавних исследований в области идентификации дрожжей около 75% ранее «неизвестных» видов было определено традиционными методами. На основании изложенного можно утверждать, что фенотипические методы до сих пор себя не изжили, хотя они требуют больших затрат труда и време­ни.

Фенотипическое описание дрожжей включает следующие этапы:

• деление клеток. Выявление способов размножения (почкованием или деле­нием клеток), определение морфологии клеток (рис.8.1.);

• выявление наличия или отсутствия гифов и псевдогифов;

• выявление наличия или отсутствия половых образований;

• выявление способности сбраживать углеводы;

• определение способности к размножению на определенных углерод- и азот­содержащих, а также на других специфических культуральиых средах.

 

 

Рис. 8.1.Вегетативное размножение: а — мультилатеральное почкование; б — би­полярное почкование; в — полярное почкование на широком (слева) и узком (справа) участках; г — деление клетки; д — псевдогифы; е — истинные гифы.

Вегетативное размножение. Виды дрожжей родовSaccharomyces, Zygosaccharomyces делятся путем мультилатерального почкования(рис.8.1,а),тогда какНатетаsроrа–путем биполярного почкования(рис.8.1,б). Базидиомицетам также свойственны разные типы почкования. Большинство из них размножается путем полярного почкования(рис.8.1,в)–либо на узком основании, либо вблизи полюсов. Некоторым базидиомицетам свойственно типичное мультилатеральное почкование, тогда как другим свойственно и почкование, и деление (рис.8.1,г). При исследовании молодой (24-48 ч) быстро развивающиеся культуры почкующиеся клетки легко распознаются. Клетки же, размножающиеся делением, вскоре образуют концентрическую колонию вокруг исходной, так что способ раз­множения в данном случае не очевиден.

Дрожжи рода Candida (синоним Torulopsis) идентифицируют по критерию образова­ния псевдогифов, причем признается, что хотя некоторые виды, классифицируемые как Torulopsis, образуют псевдогифы (рис.8.1,д), мицелий такого типа образуют не все штаммы дрожжей рода Candida. Образование истинных гифов также может служить при­знаком для различения штаммов (рис.8.1,е).

Половые образования.Половые образования нередко формируются перед конъюгацией,кото­рая происходит или между отдельными клетками, или между клеткой и ее почкой (рис. 8.2). Если в качестве конъюгата выступает почка, то место соединения зача­стую слегка удлиняется и стенка почки под микроскопом может выглядеть тоньше. Виды, для которых характерна конъюгация между клеткой и ее почкой, почти всег­да гомоталломные.

Рис.8 .2.Типы конъюгации клеток:

а — конъюгация между отдельными клетками;

б — конъюгация между клеткой и ее почкой, слегка удлиненной.

 

Неконъюгированные аски образуются как гомо-, так и гетероталломными диплоидными штаммами. Неспособность штаммов формировать половые образования может сви­детельствовать об отсутствии необходимых условии или о принадлежности данной культуры к родственному типу.

Большинство микробиологических лабораторий идентифициру­ют ДВПП фенотипическими методами. Они очень трудоемки, требуют продол­жительного времени и зачастую дают неопределенный результат. По­высить надежность идентификации позволяет способ с использованием микроттровальных кювет, включающая в себя сравнительно большое количество тестов, основанных на процессах культивирования. Вместе с тем, если при исполь­зовании стандартных тестов существует определенная вероятность ошибочности идентификации, то не следует ожидать большей точности и от ускоренных методов идентификации.

Методы анализа на молекулярном уровне предоставляют быстрое и точное средство иденти­фикации видов микроорганизмов. Их можно использовать в том числе и об­наружения новых видов ДВПП. Потребность в количественной оценке генетического сходства штаммов и видов на молекулярном уровне была удовлетворена, в частности, благодаря методике реассоциации или гибридизации ядерной ДНК. ДНК из двух представляющих ин­терес видов разделяют, смешивают и выделяют однонитевую последовательность, после чего степень сходства определяют по уровню реассоциации. Для измерения применяют различные способы: как спектрофотометрические, так с помощью ра­диоизотопов или других маркеров. Результат измерения комплементарности ДНК обычно выражают процентом связанности, но оно может вводить в заблужде­ние, так как цепочки ДНК перед дуплексированием должны иметь подобие базовых сегментов не менее 75-80%, а результаты должны соотноситься со шкалой сход­ства. Существенное влияние на образование двойной спирали ДНК ока­зывают условия эксперимента, однако при проведении измерений в оптимальных условиях различные методы оценки сходства ДНК дают практически одинаковый результат. Процент сходства ДНК позволяет примерно оценить общее подобие геномов двух микроорганизмов, однако данным методом невозможно обнаружить различия в одном гене или безошибочно определить плоидность, хотя в некоторых случаях может быть выявлена анеуплоидия.

Основной вопрос – как интерпретировать данные о реассоциации ДНК. Счи­тается, что по общему фенотипу штаммы с 80%-ным и более сходством ядерной ДНК относятся к одному виду дрожжей. Данное положение было про­верено на основании концепции биологического вида – насколько способ­ность к воспроизведению отдельных штаммов связана с разной степенью сходства ДНК. Было показано, что виды с 25%-ным сходством ДНК дают огромное чисто способов межвидового спаривания, но при этом образование асков ограни­чено, а аскоспоры вообще не образуются. Поскольку видовые барьеры очень сложны и определяются разными факторами, индикатором принадлежности микроорганизмов к одному виду должно считаться сходство ДНК в 70- 100%.

Наиболее надежным молекулярным методом сегод­ня представляется определение последовательностей ядерно- и митохондриально-кодированных генов, однако собственно процесс секвенирования гена можно провести далеко не в каждой лаборатории. Следовательно, необходима разработка ускоренных и простых в применении методов идентификации на молекулярном уровне. Благодаря методам, основанным на полимеразной цепной реакции (снятие «отпечатков пальцев» ПЦР-микросателлитов, типирование) в настоящее время существует возмож­ность дифференциации отдельных штаммов ДВПП, принадлежащих как к одному виду, так и к разным видам, а также установления источника их происхождения. Тем не менее эти методы типирования, скорее всего, вскоре будут вытеснены метода­ми с использованием зондов, чипов и т. п.

 

8.3.  ИНДИКАЦИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЛЕСЕНЕЙ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ПОРЧУ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

В процессах порчи пи­щевых продуктов и их ферментации участвуют плесени, представляющие собой гифовые грибы, некоторые виды которых продуцируют микотоксииы. Меры контроля роста плесеней в пищевых продуктах путем предот­вращения попадания их спор в пищевые продукты, путем регулирования температуры, влажности и содержания кислорода в условиях хранения изделий, с помощью кон­сервантов и других пищевых добавок полностью не ис­ключают возможности воздействия плесеней на качество и безопасность пищевых продуктов.Поэтому необходимо уметь их обнаруживать в готовых издели­ях, а также в ходе процессов переработки, упаковки и хранения пищевых продуктов.

До п середины ХХ века плесени идентифицировали методом культивирования на питательных средах в чашках Петри с последующим микроскопированием. В дальнейшем для подавления размножения бактерий питательные среды на­чали подкислять, что способствовало размножению дрожжей и плесеней, однако особо специфической среды подобрать не удалось. Впоследствии подкисленные питательные среды были заменены средами с антибио­тиками, биохимическими реагентами или красителями, замедляющими рост бакте­рий и позволяющими развиваться дрожжам и плесеням.

 

---

Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 472; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!