Серологические реакции в диагностике инфекционных болезней
И идентификации микроорганизмов
Краткая характеристика серологических реакций
Иммунологические реакции in vitro используют в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний и иммунологических исследованиях. Методы диагностики инфекционных заболеваний, основанные на определении специфических АТ в сыворотке крови, относят к серологическим.
Серологические реакции применяют в двух направлениях:
1. Выявление с диагностической целью АТ в сыворотке крови обследуемого при наличии набора известных АГ. В качестве АГ применяют взвеси микроорганизмов (вирусы, бактерии, грибы, простейшие и др.), инактивированные химическими или физическими методами, или используют диагностикумы, представляющие фракции микроорганизма. Как правило, результаты серологической диагностики получают при исследовании парных сывороток крови больных, взятых в первые дни болезни и через определенные промежутки времени от начала заболевания.
2. Определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизма или его АГ при взаимодействии с известными иммунными сыворотками. Иммунные сыворотки должны содержать АТ в высоком титре и быть строго специфичными. В лабораторной практике применяют серологические реакции, основанные на прямом взаимодействии АГ с АТ (агглютинация, преципитация) и опосредованные реакции (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента), а также реакции с использованием меченых АТ или АТ (иммуноферментный метод, радиоиммунный метод, метод флуоресцирующих АТ).
|
|
|
Процесс взаимодействия АГ с АТ протекает в две фазы. Специфическая фаза – взаимодействие, при котором происходит комплементарное соединение активных центров АТ и АГ. Она длится от нескольких секунд до нескольких минут. Специфической фаза названа потому, что с АГ, попавшим в организм, может соединиться только подходящее к нему, так называемое комплементарное АТ. Неспецифическая фаза – проявление внешних признаков образования иммунных комплексов (помутнение, выпадение осадка и так далее). Она длится от нескольких минут до нескольких часов.
Внешние проявления реакции АГ–АТ зависят от многих факторов: физико-химических свойств АГ (размеры, физические характеристики), от класса и вида АТ, от условий опыта (консистенции среды, концентрации солей, рН, температуры). Поливалентность АТ (способность образовывать больше двух связей) и АГ обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это можно объяснить тем, что к образовавшемуся комплексу АГ-АТ могут присоединяться другие молекулы АТ и АГ на свободные активные центры. В результате формируются довольно крупные агрегаты, которые могут выпасть в осадок.
|
|
|
Еще одной особенностью является то, что наиболее интенсивно реакции АГ-АТ проявляются, если компоненты находятся в эквивалентных соотношениях, то есть лишних АТ и АГ после реагирования не остается.
Иммунологические реакции, благодаря высокой специфичности и чувствительности, применяют для выявления и количественного определения АГ и АТ. Для выявления неизвестного АГ используют диагностические иммунные антисыворотки. Их получают путем многократной иммунизации лабораторных животных известным АГ. Обнаружение АТ проводят с использованием известных АГ, которые представляют собой взвесь убитых микроорганизмов, инактивированных высокой температурой, химическими веществами, ультразвуком, рентгеновскими лучами или ультрафиолетовым облучением.
Реакции агглютинации (РА)
Реакция агглютинации – реакция склеивания корпускулярных АГ (микробы, эритроциты и т. д.) специфическими АТ. Образовавшийся при этом комплекс выпадает в осадок. Эту реакцию проводят для определения наличия определенных АГ или АТ. На стекле к капле сыворотки добавляется взвесь бактерий, выделенных от больного. Если капля мутнеет, значит, агглютинация произошла, и в организме присутствует тот АГ, к которому были АТ (известные) в исходной сыворотке. Также эту реакцию проводят в пробирке. Для этого в несколько пробирок наливают сыворотку крови больного с неизвестными АТ, потом к этим образцам добавляют известные диагностикумы (убитые бактерии) и наблюдают, в какой пробирке произойдет помутнение или выпадение осадка.
|
|
|
Реакция агглютинацииявляется двухфазной: в первой фазе происходит специфическое связывание АГ и АТ, во второй – осаждение солями образовавшегося агрегата, являющегося гидрофобным. Основываясь на этом представлении, принято разделять агглютинины на полные и неполные. Неполные АТ – агглютинины, которые из физиологического раствора не могут осаждать клетки или частицы, даже если они связываются с ними. Классификация агглютининов, основанная на методах их выявления:
I. Полные агглютинины.
II. Неполные агглютинины:
1) блокирующие АТ, определяемые в тесте блокирования;
2) агглютиноиды, определяемые в среде сыворотки, плазмы, альбумина;
3) неполные АТ, выявляемые с помощью антиглобулиновой реакции Кумбса;
4) криптагглютиноиды, выявляемые после предварительной обработки эритроцитов ферментами;
|
|
|
5) агглоиды, обнаруживаемые с помощью коллоидных посредников (поливинилпирролидона, желатина, декстрана и др.).
Полные и неполные агглютинины находятся в основном в γ-глобулиновой фракции сыворотки крови. В процессе иммунизации вначале появляются полные АТ, в случае продолжающейся сенсибилизации появляются АТ, способные вызвать агглютинацию лишь при определенных условиях.
Полные и неполные АТ имеют отличительные признаки по физико-химическим свойствам и серологической характеристике. Так, неполные АТ более термостабильны по сравнению с полными, в то время как полные менее устойчивы и снижают свою активность даже при хранении в замороженном состоянии. Полные АТ имеют большую авидность к соответствующим АГ по сравнению с неполными.
Реакция гемагглютинации
Реакцию агглютинации эритроцитов, или гемагглютинация (РГА), широко используют для обнаружения антиэритроцитарных АТ (определение групп крови), а также АГ в исследуемых образцах эритроцитов или тканей с помощью специфических антисывороток.
Агглютинация в солевой среде – наиболее простой метод выявления полных агглютининов. Реакцию можно проводить как на плоскости (более быстрый метод), так и в пробирках (для более точного количественного учета АТ в сыворотке). Для реакции необходимы исследуемая сыворотка или сыворотка известной специфичности и взвесь эритроцитов, приготовленная из свежевзятой крови, отмытой от примеси плазмы физиологическим раствором. С этой целью в пробирку с 8–10 мл физиологического раствора берут несколько капель крови, перемешивают и центрифугируют в течение 5–7 минут при 3000 об/мин. Затем сливают надосадочную жидкость, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор до нужного объема, перемешивают путем встряхивания и вновь центрифугируют. После троекратного отмывания из осадка эритроцитов готовят 2–5 %-ную взвесь эритроцитов в физиологическом растворе.
Агглютинация в пробирках (планшете для агглютинации). В ряд агглютинационных пробирок (кроме первой) вносят по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора. Затем в первую и вторую пробирки добавляют по 0,1 мл (2 капли) тестируемой сыворотки и, начиная со второй пробирки, переносят после перемешивания пипеткой по 0,1 мл (2 капли) разведенной сыворотки в каждую последующую пробирку, получая, таким образом, ряд разведений сыворотки, кратных 2. Затем в каждую пробирку вносят по 0,05 мл (1 капля) 2 %-ной взвеси эритроцитов. В качестве контроля берут нормальную сыворотку и физиологический раствор с используемой взвесью эритроцитов. После встряхивания пробирки помещают в термостат при температуре плюс 37 °С на 30–60 минут или выдерживают при комнатной температуре (плюс 18 °С) или при температуре плюс 4 °С (в зависимости от задач исследования). После инкубации проводят оценку реакции без предварительного центрифугирования по форме осадка или после центрифугирования (при 1500 об/мин в течение одной минуты) по характеру сгустка. Для более точного учета реакции используют агглютиноскоп или просматривают под малым увеличением микроскопа или лупой. Оценка интенсивности агглютинации проводится по следующей схеме:
· Резко выраженная агглютинация (++++). При встряхивании комочек эритроцитов не разбивается, жидкость совершенно прозрачна. Под микроскопом все поле зрения занято одним агглютинатом.
· Умеренная агглютинация (++). Осадок при встряхивании разбивается на несколько отдельных комков, небольшая часть эритроцитов находится в свободном состоянии и хорошо выявляется под микроскопом.
· Слабая агглютинация (+). Агглютинаты мелкие, бóльшая часть эритроцитов взвешена в жидкости. Под микроскопом на фоне отдельных эритроцитов видны небольшие агглютинаты.
· Отрицательная реакция (–). Гомогенная мутная взвесь эритроцитов в жидкости, под микроскопом склеенные эритроциты не выявляются.
Наибольшее разведение сыворотки, при котором еще обнаруживается агглютинация эритроцитов, принимается за титр агглютининов.
Реакция агглютинации при бактериальных инфекциях
Реакция агглютинации в инфекционной иммунологии широко применяется для диагностики различных инфекционных заболеваний, для идентификации микроорганизмов, выделенных от больных и бактерионосителей. Реакция агглютинации применяется для решения вопросов диагностики в двух аспектах: 1) диагностика заболевания путем обнаружения в крови больного АТ к соответствующему виду микроба; 2) идентификация микроба, выделенного из организма больного или из внешней среды с помощью известной агглютинирующей сыворотки.
Для постановки реакции агглютинации необходимы три основных компонента: сыворотка, АГ (диагностикум) и физиологический раствор. В качестве АГ чаще всего применяют готовые диагностикумы, которые представляют собой микробов, убитых тем или иным способом, в виде взвеси определенной концентрации или в высушенном состоянии. АГ может также служить взвесь, приготовленная из любой лабораторной культуры микробов, при условии сохранения ими типичных свойств и отсутствия спонтанной агглютинации в физиологическом растворе. Достоверными можно считать результаты реакции только при хороших четких контролях. За титр АТ принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на ++.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
РНГА применяют в двух вариантах: с известными АГ для обнаружения АТ или с известными АТ для выявления АГ. Эта реакция специфична, и применяют ее для диагностики заболеваний, вызванных бактериями и риккетсиями. Для постановки РНГА используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные путем адсорбции на эритроцитах АГ или АТ в зависимости от цели исследования (рис. 52). В положительных случаях степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеивающихся эритроцитов (зонтик), покрывающей дно пробирки; наличие пленки с фестончатыми кружевными краями обозначают двумя плюсами. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызывавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса.
Рис. 52. РНГА: 1 – эритроциты, 2 – АГ эритроцита, 3 – конъюгированный АГ, 4 – АТ
РГА и реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Как уже говорилось, в основе РГА лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных АГ. В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензию хорион-аллантоисных оболочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур или органов животных, зараженных вирусами, нативный инфекционный материал. РГА не является серологической реакцией, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки и используется для выбора рабочего разведения АГ для постановки РТГА или наличия АГ (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции используются эритроциты животных, птиц, человека I (0) группы крови. Для постановки ориентировочной РГА на предметное стекло наносят каплю 5 %-ной взвеси эритроцитов и каплю испытуемого материала, тщательно смешивают. При положительном результате через 1–2 минуты макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов. Для постановки РГА в развернутом ряду в лунках полистироловых планшетов готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на физиологическом растворе в объеме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25–1 %-ной взвеси эритроцитов. Результаты учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов, покрывающей дно пробирки (зонтик), реакцию с просветами в пленке отмечают тремя плюсами, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями из склеившихся эритроцитов обозначают двумя плюсами, хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов, соответствует одному плюсу. Резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля, показывает отсутствие агглютинации. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса. При положительном результате РГА исследование продолжают, определяя тип выделенного вируса с помощью РТГА типоспецифическими сыворотками. РТГА основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфичными АТ вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. При ориентировочном типировании вирусов используют капельный метод на стекле. Для окончательного установления типовой принадлежности выделенного вируса и титрования АТ в сыворотках ставят развернутую РТГА в пробирках или в лунках. С этой целью готовят двукратные разведения сывороток на физиологическом растворе и разливают по 0,25 мл. К разведениям сыворотки прибавляют по одной капле материала, содержащего вирус, и по одной капле 1 %-ной взвеси эритроцитов. При использовании РТГА для определения типа вируса используют типоспецифические сыворотки, которые добавляют к равному объему рабочего разведения АГ. Типовую принадлежность выделенного вируса устанавливают по специфической иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр АТ к этому вирусу. РГА и РТГА широко применяются для диагностики вирусных инфекций (клещевой энцефалит, грипп и др.) с целью обнаружения специфических АТ и для идентификации многих вирусов по их АГ.
Реакция пассивной гемагглютинации
Для определения АТ к ДНК чаще используют реакцию пассивной гемагглютинации. С этой целью АГ (ДНК) вначале осаждают на эритроцитах барана, а затем добавляют к ним исследуемую сыворотку. Если в сыворотке содержатся АТ к ДНК, происходит агглютинация эритроцитов и их гемолиз. В зависимости от типа используемого АГ удается выделить несколько типов АТ к ДНК: I тип – АТ к односпиральной ДНК, II тип – к термоденатурированной ДНК, III тип – к нативной двуспиральной ДНК. Определение типа АТ позволяет проводить дифференциальную диагностику различных заболеваний (см. ниже).
Неполные АТ к эритроцитам обнаруживаются при помощи прямого и непрямого теста Кумбса. Непрямая проба Кумбса основана на выявлении агглютинации эритроцитов, нагруженных неполными АТ, которая появляется при добавлении антиглобулиновой сыворотки. Проба осуществляется в два этапа. Вначале проводится сенсибилизация стандартных резус-положительных эритроцитов донора О (I-ой) группы. Каплю взвеси эритроцитов вносят в пробирку, наслаивают на них несколько капель исследуемой сыворотки, в которой предполагают наличие АТ к эритроцитам, и инкубируют 40 минут при плюс 37 °С. Эритроциты осторожно отмывают от сыворотки физиологическим раствором. Неполные АТ, если они присутствуют в исследуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах, но не могут вызвать их агглютинацию (рис. 53а). На втором этапе пробы на сухую тарелку наносят каплю стандартной антиглобулиновой сыворотки, содержащей АТ к человеческим иммуноглобулинам, и добавляют туда эритроциты, на которых предположительно фиксированы неполные АТ исследуемой сыворотки. Если на предыдущем этапе исследования на поверхности эритроцитов действительно фиксировались противоэритроцитарные АТ, последние взаимодействуют с АТ к иммуноглобулину стандартной антисыворотки (рис. 53б). В результате происходит агглютинация (склеивание) эритроцитов.
Рис. 53. Схема проведения непрямой пробы Кумбса: а, б – первый и второй этапы исследования
При прямой реакции Кумбса используют собственные эритроциты пациента, которые предположительно уже были сенсибилизированы аутоАТ. Эритроциты добавляют в антиглобулиновую сыворотку: при наличии на их поверхности фиксированных иммуноглобулинов (АТ к эритроцитам) возникает агглютинация эритроцитов. АутоАТ к эритроцитам обнаруживают: при аутоиммунных гемолитических анемиях; при гемолитической болезни новорожденных; при системных заболеваниях соединительной ткани; при хроническом активном гепатите и других заболеваниях.
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК)
В последние годы большое диагностическое значение придают определению в сыворотке крови ЦИК. Они представляют собой растворимые комплексы АГ-АТ, которые в норме фагоцитируются макрофагами и разрушаются. Для определения ЦИК используют метод осаждения (преципитации) ЦИК в растворе полиэтиленгликоля. После инкубации и центрифугирования выпавшие в осадок ЦИК растворяют раствором едкого натра и определяют их содержание в полученном растворе на спектрофотометре, выражая количество иммунных комплексов в единицах оптической плотности. Определение ЦИК в сыворотке крови возможно также с помощью метода иммунофлуоресценции. Увеличение концентрации ЦИК может иметь два важных в практическом отношении следствия. Во-первых, ЦИК могут приводить к повреждению мембран и способствовать развитию иммунопатологического процесса в органах. Особенно часто это наблюдается при снижении функциональной активности тканевых макрофагов. Во-вторых, ЦИК обладают способностью активировать систему комплемента, хемотаксическим действием по отношению к лимфоцитам и нейтрофилам, активируют систему свертывания крови, кининовую систему, выделение гранулоцитами и макрофагами биологически активных веществ и т. д. Эти эффекты ЦИК сопровождаются развитием воспаления тканей. Повышение концентрации ЦИК обнаруживают при многих заболеваниях, в основе которых лежат нарушения клеточного иммунитета, в первую очередь, при различных аутоиммунных заболеваниях.
Реакции преципитации (РП)
В основе механизма РП лежит выпадение из раствора нерастворимого комплекса АГ-АТ. РП позволяет обнаруживать ничтожные количества белкового АГ (до разведения 1 : 1 000 000). РП в этом отношении чувствительнее многих химических реакций, хотя в свою очередь уступает по чувствительности реакции связывания комплемента и анафилаксии. РП нашла широкое применение для определения степени родства видов животных и растений.
РП основана на взаимодействии АГ и АТ в эквивалентных количествах. Кольцепреципитация – появление непрозрачного кольца преципитата при постепенном наслаивании растворимого АГ на иммунную сыворотку. Например, для определения АГ сибирской язвы используют сыворотку крови иммунизированных лошадей, при этом кольцо преципитата появляется в течение 2-х минут. Также эту реакцию можно проводить на твердых средах (агаре). При этом в два углубления среды (агара) помещают сыворотку и взвесь бактерий – между ними образуется зона преципитации. Эти реакции используют для определения АГ бактерий, тканей человека и животных, диагностики некоторых инфекционных заболеваний, определения видовой принадлежности белка в судебной медицине.
Феномен преципитации заключается во взаимодействии мелкодисперсных АГ (преципитиногенов) с соответствующими АТ (преципитинами) и образованием преципитата (рис. 54). Постановку РП осуществляют двумя методами: в жидкой среде – по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации или в плотной среде – агаровом геле. РП применяют в двух целях: выявление АГ по известной иммунной преципитирующей сыворотке или АТ с использованием известных АГ. Существует много вариантов постановки реакции, но чаще всего используют следующие методики: реакция преципитации в агаровом геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза, реакция флокуляции, кольцепреципитации.
|
| Рис. 54. РП: 1 – АГ, 2 – АТ |
Реакцию кольцепреципитации применяют для выявления АГ с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические АТ. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содержащую определенный АГ. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1–0,5 мл. В случае соответствия АГ и АТ на границе между ними через 3–5 минут образуется кольцо преципитации (рис. 55а). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение АГ и АТ.
При постановке реакции преципитации в геле по Оухтерлони используют 1 %-ный агар Дифко, который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением – штампом для просечения контуров лунок в геле. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый АГ, в другую – иммунную сыворотку. АГ и АТ диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно – через 24–48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра АТ, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток (рис. 55б).
Рис. 55. РП: а – реакция кольцепреципитации, б – реакция преципитации по Оухтерлони
Метод радиальной иммунодиффузии
Принцип наиболее простого и распространенного метода радиальной иммунодиффузии заключается в оценке диаметра колец преципитации, возникающих при взаимодействии в геле АГ (в данном случае иммуноглобулина исследуемой сыворотки) и АТ (АТ к иммуноглобулинам человека, содержащимся в стандартных антисыворотках).
Стандартные антисыворотки с АТ к IgG, IgМ, IgА смешивают с расплавленным агаром. Эту смесь заливают на специальные пластины. После ее застывания на каждой пластине специальным пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм (рис. 56а). В лунки микропипеткой вносят по 2 мкл последовательных разведений (1 : 1, 1 : 2, …, 1 : 8) стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов, а также такое же количество разведений исследуемой сыворотки (с неизвестным содержанием иммуноглобулинов).
Пластины инкубируют при плюс 4 °С в течение 24 часов и затем оценивают результаты. АГ (иммуноглобулин стандартной или исследуемой сыворотки) диффундирует в слое агара, содержащего АТ к человеческим иммуноглобулинам, в результате чего вокруг лунок образуются кольца преципитации (рис. 56б). Чем выше концентрация иммуноглобулинов, тем больше диаметр кольца. Вначале оценивают размеры колец преципитации вокруг лунок, в которые были внесены стандартные сыворотки различного разведения с известной концентрацией иммуноглобулинов. По этим результатам строят кривую, отражающую зависимость между диаметром (площадью) кольца преципитации и концентрацией иммуноглобулина (рис. 56в). Такую кривую строят для каждой пластины. Затем измеряют диаметр колец преципитации в испытуемом препарате и по стандартной калибровочной кривой определяют искомую концентрацию иммуноглобулинов.
Для количественного определения IgE, присутствующего в сыворотке крови в низких концентрациях, применяют более точные методы радиоиммунного или иммуноферментного анализа.
Рис. 56. Схема определения концентрации иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии: а – внесение стандартной и исследуемой сыворотки в лунки пластины с залитым агаром, содержащим АТ к иммуноглобулинам, б – фрагмент пластины после инкубации (видны кольца преципитации, диаметр которых зависит от концентрации иммуноглобулинов), в – калибровочная кривая зависимости диаметра колец преципитации от концентрации иммуноглобулинов стандартной сыворотки
Реакция кольцепреципитации
Реакцию кольцепреципитации используют в основном для определения моноклональных иммуноглобулинов, например, парапротеинов при миеломной болезни или макроглобулинемии Вальденстрема. Метод представляет собой сочетание электрофоретического разделения белков сыворотки крови (или других биологических сред) и последующей радиальной иммунодиффузии с образованием преципитатов.
Для проведения реакции расплавленный агар наносят на предметное стекло и делают в нем лунку (рис. 57а). В лунку вносят исследуемую сыворотку и пластину помещают в электрическое поле, под действием которого происходит разделение различных белков сыворотки крови (рис. 57б). По окончании электрофореза в агаровой пластине вырезают траншею, в которую вносят стандартную антисыворотку, содержащую АТ к определенным АГ (например, парапротеину) (рис. 57в). Если в исследуемой сыворотке имеются искомые АГ (парапротеин), уже через несколько суток в агаровом слое образуются полосы преципитации (рис. 57г).
Метод иммуноэлектрофореза чаще используется для идентификации низких концентраций парапротеина при миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема и т. д.
| Рис. 57. Схема метода иммуноэлектрофореза: а – внесение в лунку исследуемой сыворотки с искомым АГ, б – электрофоретическое разделение белков исследуемой сыворотки, в – внесение в траншею стандартной антисыворотки с АТ к искомому АГ, г – появление дуг преципитации при наличии в исследуемой сыворотке искомого АГ |
Метод радиальной иммунодиффузии (по Манчини)
Количество и соотношение иммуноглобулинов отдельных классов в биологических жидкостях отражают состояние В-системы. Иммунную сыворотку против АТ определенного класса (IgG, IgM, IgA) вносят в расплавленный агаровый гель. После застывания агара АТ в нем равномерно распределены. Внесенный в лунку исследуемый материал (АГ) радиально диффундирует в толщу геля. Поскольку концентрация АТ везде одинакова, то в результате реакции АГ-АТ в зоне эквивалентности образуются не полосы преципитации, а кольца преципитации вокруг лунки с АГ. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации АГ в исследуемой жидкости.
В предварительных опытах определяют оптимальное рабочее разведение антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов стандартной сыворотке и по отношению к ней определяют количество иммуноглобулинов в исследуемом материале.
Используют 3 %-ный агар Дифко на веронал-мединаловом буфере рН 7,3–7,4 (мединал – 35,4 г, веронал – 5,25 г, дистиллированная вода – до 1000 мл). В бактериологической пробирке смешивают по 5 мл расплавленного агара и антисыворотки. Берут два стекла размером 9×12 см, на одно из них помещают П-образную рамку, сверху кладут второе стекло. Толщина рамки составляет 1 мм. В щель между стеклами заливают смесь агара и антисыворотки и оставляют в вертикальном положении для застывания агара на 15–20 минут. Затем удаляют одно из стекол и рамку.
В агаре пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм (5 рядов по 7 лунок в каждом). В лунки первого ряда вносят разведения стандартной сыворотки, в остальные – исследуемые пробы по 1 мкл. Пластинку выдерживают во влажной камере 24 часа (IgG, IgA) или 48 часов (IgM).
Строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают значения диаметров колец преципитации разведенной стандартной сыворотки, на оси ординат – значения концентраций иммуноглобулинов ( % или мг/мл). Измеряют диаметр колец преципитации в пробах и по калибровочной кривой устанавливают концентрацию соответствующего иммуноглобулина.
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 620; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!