Унифицированные требования по технологии
Лабораторной обработки биопсийного (операционного) материала
Подбор оборудования для проводки следует осуществлять исходя из фактически сложившегося объема материала с учетом рекомендуемой средней нагрузки на аппарат.
Окончательная фиксация
При аппаратных методах проводки всегда следует первым шагом устанавливать окончательную фиксацию материала продолжительностью не менее 2-3 часов, независимо от того, насколько полноценно материал зафиксирован до загрузки в аппарат. Этого времени, при адекватных размерах кусочков, как правило, достаточно, чтобы нивелировать незамеченные недостатки предварительной фиксации материала. Но и при этом, не следует помещать в одну корзину (реакционную емкость) кассеты со слишком разнородным материалом. Загрязняющие фиксирующую жидкость примеси крови от соскобов эндометрия или жира от жировой клетчатки и атером могут ухудшить качество фиксации других тканевых образцов, и, кроме того, будут способствовать увеличению расхода фиксирующей жидкости, которую придется менять перед каждым новым циклом проводки.
Проводка
Традиционно для комплекса первичной лабораторной обработки тканей для морфологических исследований, включая фиксацию, промывку, обезвоживание и пропитку материала, используются аппараты для проводки тканей карусельного или процессорного типа (тканевые процессоры).
|
|
|
Выбор оборудования для проводки[33]
Традиционно в морфологических лабораториях широко используются тканевые процессоры карусельного типа. Наиболее распространены аппараты АТ-4М (Россия), Leica TP1020 (Germany), Microm STP120/122 (Germany), Sakura Rotary (Japan) и Shandon Citadel 2000 (Unated Kindom). Это приборы относительно небольшой производительности и минимально защищенные от испарений.
В приборах Leica TP1020, Microm STP120/122 и Shandon Citadel 2000 имеется техническая возможность двойной загрузки, что обеспечивает увеличение их производительности соответственно до 220, 360 и 110 кассет за один цикл. Таким образом, наименьшей производительностью из сравниваемых приборов обладает Shandon Citadel 2000, наибольшей – Microm STP120/122. В качестве дополнительной опции для улучшения качество проводки материала в Leica TP1020 предлагается вакуумная пропитка. Следует также обратить внимание на удобство очистки приборов – у Leica TP1020, Microm STP120/122 и Sakura Rotary контейнеры съемные, тогда как в Shandon Citadel 2000 доступ к ним ограничен. Существенным отличием Leica TP1020 является возможность отсроченного старта до 9 дней.
Среди высокотехнологичных тканевых процессоров, представленных на рынке, отметим Leica ASP300 (Germany), Microm STP420 (Germany), Sakura VIP5 (Japan) и Shandon Hypercenter XP (Unated Kindom).
|
|
|
Общими признаками этой группы приборов являются высокая производительность (300 и более кассет за один цикл, исключение составляет лишь Shandon Hypercenter XP, производительность которого в два раза ниже) и схожие технологические решения – такие как закрытый контур, полная защита от испарений, автоматизация основных технологических операций, возможность внешнего контроля технологического процесса. При этом Leica ASP300 оснащен одной ретортой на 300 кассет, Microm STP420 двумя с такой же суммарной вместимостью, Sakura VIP5 оснащен одной ретортой вместимостью 360 кассет. Функция контроля уровня реагентов предусмотрена во всех образцах кроме Microm STP420.
В технологии Leica ASP300 и Microm STP420 предусмотрено использование вакуума, причем в Microm STP420 имеется два фиксированных режима – 26КПа и 74КПа, а в Leica ASP300 уровень отрицательного давления регулируется автоматически.
Все приборы оснащены программами очистки – в Leica ASP300 имеется четыре стандартных программы различной продолжительности, в Sakura VIP5 – две стандартные программы, в Microm STP420 программа очистки устанавливается произвольно.
Объем емкостей для реагентов имеет значение для оценки их расхода – но минимальные по объему емкости предлагаются в Sakura VIP5 (возможны комплектации с емкостями объемом либо 2,7 л, либо – 3,7 л), самыми большими емкостями (объемом 5 л) комплектуется Microm STP420.
|
|
|
Наиболее удобное в работе сенсорное управление использовано в Leica ASP300 и Microm STP420, напротив – Sakura VIP5 оснащается обычным жидкокристаллическим дисплеем и управляется с помощью клавиатуры.
В приборах Leica ASP300 и Microm STP420 возможно использование любых реагентов, что обеспечивает определенную гибкость, возможность выбора, реализацию отдельных профессиональных предпочтений специалистов с учетом конкретных экономических условий деятельности лаборатории. Напротив – Sakura предлагает для своего прибора полную линейку стандартных готовых к употреблению реагентов, в том числе – неформалиновый фиксирующий агент и бесксилольную технологию пропитки.
Особое место в ряду тканевых процессоров занимает гистоконвейер Sakura Tissue-Tek Xpress (Japan). Прибор представляет собой новое в технологии тканевого процессинга техническое решение, основанное на поточном принципе с использованием мягкого микроволнового облучения. Sakura предлагает для своего прибора полную линейку стандартных готовых к употреблению реагентов, в том числе – неформалиновый фиксирующий агент и бесксилольную технологию пропитки.
|
|
|
Технология проводки
1. Программу проводки необходимо выбирать в зависимости от типа ткани и размеров образцов. Слишком длинная программа для маленьких (например, эндоскопических) биопсий или слишком короткая для крупных образцов, особенно содержащих жировую ткань (молочная железа и др.), может привести к дефектам проводки материала. Вариантов программ проводки может быть множество, и по большому счету не важно – какому из этих вариантов отдается предпочтение, важно конечное качество гистологических препаратов и какой ценой это достигается. Всегда наиболее предпочтительно использовать надежную, апробированную программу проводки, в случае если она дает хороший и стабильно воспроизводимый результат. Модернизация программ может потребоваться, например, при решении задач увеличения производительности патолого-анатомического отделения. При этом изменения в привычную программу проводки рекомендуется вводить пошагово, четко документируя все нововведения, сколь незначительными они бы ни казались, с оценкой получаемых результатов путем пробных проводок малых партий материала.
2. При переходе от ручных методов проводки к аппаратным начинать следует с программ, рекомендуемых фирмой-производителем, с последующей их коррекцией исходя из особенностей конкретного материала. При этом изменения в стандартную программу проводки рекомендуется вводить пошагово, четко документируя все нововведения, сколь незначительными они бы ни казались, с оценкой получаемых результатов путем пробных проводок малых партий материала.
3. Программы проводки следует подбирать исходя из конкретных технологических условий лаборатории, видов и объемов исследуемого материала. Не редко в патолого-анатомическом отделении одновременно используется несколько программ проводки – например, для малых биопсий, для операционного материала, для аутопсийного материала. Кроме стандартной плановой программы проводки, в некоторых отделениях требуется выполнять ускоренную проводку материала – в таких случаях полезны дополнительные технические возможности современных гистологических процессоров – такие как вакуум, повышенное давление, микроволновое облучение и др.
4. Укорочение стандартной процедуры проводки возможно только с применением дополнительных методов физического воздействия на образцы, ускоряющих пропитывание ткани – таких как вакуум, повышенное давление, микроволновое облучение и др.
5. Остатки формалина при недостаточном его отмывании способствуют задержке в тканях капель воды, не удаляемых при процедуре дегидратации – в этих участках не будет полноценного пропитывания парафином. Потому не следует произвольно укорачивать время отмывки после формалина, причем чем кусочки большего размера – тем время отмывания должно быть больше.
6. Произвольное укорочение времени дегидратации и пропитывания при обычных внешних условиях проводки (температура, давление и проч.) могут привести к резкому ухудшению качества пропитывания ткани. Недостаточная дегидратация ткани возможна при произвольном укорочении процедуры или при использовании загрязненных спиртовых растворов. Оставшиеся в тканях капли воды препятствуют полноценному пропитыванию образца парафином.
7. Высушивание образцов возможно при использовании в процедуре проводки хлороформа вместо ксилола. Хлороформ очень летуч и потому быстро испаряется с поверхности кусочков, вызывая их высушивание и растрескивание. При использовании хлороформа в процедуре проводки следует насколько возможно сократить время пребывания кусочков на открытом воздухе при переносе между емкостями (при ручной проводке или при использовании процессоров карусельного типа). Высушивание образцов возможно и при резком увеличении времени пребывания кусочков на открытом воздухе из последней спиртовой емкости в ксилол или между ксилольными емкостями.
8. Перегрев образцов возможен при инкубации образцов в первой парафиновой емкости сильно загрязненной ксилолом при 56ºС. Дело в том, что температура плавления ксилол-парафиновой смеси приближается к 37ºС, а при 56ºС смесь близка к кипению – в результате кусочки практически «свариваются» или «пережигаются». Единственный способ избежать этого артефакта – своевременно менять первый парафин. Примеси ксилола во второй и третьей парафиновых емкостях вообще недопустимы.
9. Для оптимальной проводки и получения качественных микропрепаратов ткань должна быть хорошо зафиксирована. Если после неполной фиксации образцы ткани при проводке попадают в спирт, то возникает феномен зональной фиксации (формалиновая фиксация по периферии образца, спиртовая фиксация в центре). При аппаратных методах проводки всегда следует первым шагом устанавливать окончательную фиксацию материала продолжительностью не менее 2-3 часов независимо от того, насколько полноценно материал зафиксирован до загрузки в аппарат. Этого времени, при адекватных размерах кусочков, как правило, достаточно, чтобы нивелировать незамеченные недостатки предварительной фиксации материала. Но и при этом, не следует помещать в одну корзину (реакционную емкость) кассеты со слишком разнородным материалом. Загрязняющие фиксирующую жидкость примеси крови от соскобов эндометрия или жира от жировой клетчатки и атером могут ухудшить качество фиксации других тканевых образцов, и, кроме того, будут способствовать увеличению расхода фиксирующей жидкости, которую придется менять перед каждым новым циклом проводки.
10. Для получения наилучших результатов при проводке материала необходимо использовать реагенты высокого качества. Реагенты для проводки необходимо заменять в четком соответствии с протоколом. Предпочтительно использование системы контроля за реагентами, применяемой в современных гистологических процессорах. Использование загрязненных или разбавленных реагентов приводит к плохому качеству проводки материла.
11. Традиционно для дегидратации используется этиловый спирт (этанол). Спирты, используемые для проводки должны сохранять характерный запах, быть прозрачными. Всегда следует заменить спирты перед проводкой новой партии образцов, если они имеют мутный вид. Наиболее быстро загрязняется первая емкость с 70% спиртом, при больших объемах материала его приходится менять практически перед проводкой каждой новой партии образцов. Очень важно для адекватной дегидратации материала в последней спиртовой емкости всегда иметь чистый неразбавленный спирт – потому ее тоже надо заменять довольно часто (при использовании процессоров карусельного типа спиртовые емкости просто сдвигают на одну позицию назад).
К сожалению, возможности использования в здравоохранении спирта этилового 96-98% в настоящее время отсутствуют, и лучшее что мы можем получить для лаборатории – это «спирт медицинский 95%». Широко использовавшиеся ранее методические приемы кустарного обезвоживания спирта в лабораторных условиях с помощью сульфата меди (медный купорос) – малопроизводительны и теперь уже мало где применяются. Выходов из этой ситуации три.
Первый – четко контролировать каждую поступающую партию спирта медицинского с помощью спиртометра и корректировать методику разведения спиртов в зависимости от концентрации исходного раствора. Из опыта можем отметить, что поступающий в медицинские организации фармакопейный «спирт медицинский 95%» в реальности может иметь концентрацию основного вещества от 93,7% до 95,7%.
Второй – использовать для проводки только высококачественный ксилол квалификации не ниже «хч». Это тоже может оказаться проблемой, но вполне решаемой.
Третий – использовать для проводки высокоочищенный изопропиловый спирт (изопропанол) с концентрацией основного вещества не менее 99,5%, в котором осуществляются все этапы дегидратации и пропитки до парафина – таким образом, из использования исключаются не только этанол, но и ксилол.
12. Формалин, используемый для проводки, должен сохранять характерный резкий запах, быть прозрачным, допускается слегка желтоватый оттенок цвета. Всегда следует заменить формалин перед проводкой новой партии образцов, если он загрязнен примесью крови (красно-бурый цвет), жира (опалесцирует или имеет хорошо различимые жировые капли), мелкими фрагментами тканевых образцов из предыдущей партии проводки, или если он имеет мутный вид и осадок.
13. Промывочную воду необходимо заменять на свежую перед проводкой каждой новой партии материала независимо от того, насколько чистой она кажется глазу.
14. Ксилол, используемый для проводки должен сохранять характерный запах, быть прозрачным. Всегда следует заменить ксилол перед проводкой новой партии образцов, если он имеет мутный вид. Наиболее быстро загрязняется первая емкость ксилола, следующая за спиртом, при больших объемах материала его приходится менять практически перед проводкой каждой новой партии образцов. Очень важно для адекватной пропитки материала в последней ксилольной емкости всегда иметь чистый ксилол – потому ее тоже надо заменять довольно часто (при использовании процессоров карусельного типа и небольших партиях материала в проводке ксилольные емкости можно просто сдвигать на одну позицию назад).
15. Для получения наилучших результатов при проводке и заливке материала необходимо использовать парафин высокого качества. В настоящее время предлагается множество марок специализированного гранулированного парафина для гистологии. Основные качественные характеристики – температура плавления 56ºС (отсутствие легко- и тугоплавких фракций), гомогенность (поверхность разлома застывшего парафинового блока должна иметь равномерный мелкозернистый вид), пластичность (не растрескивается при замораживании до –20ºС). Парафин, используемый для проводки, должен быть полностью расплавленным при температуре, заданной протоколом, с легким, почти неуловимым запахом воска. Недопустимы примеси ксилола во второй и третьей парафиновых емкостях – парафин, загрязненный ксилолом, имеет резкий нехарактерный запах, более жидкую консистенцию при 56ºС, так как температура его плавления много ниже (приближается к 37ºС). Очень важно для адекватной пропитки материала в последней парафиновой емкости всегда иметь чистый парафин – потому ее тоже надо заменять довольно часто (при использовании процессоров карусельного типа парафиновые емкости просто сдвигают на одну позицию назад).
16. По возможности рекомендуется применять методы проводки без использования ксилола (реализовано в некоторых современных гистологических процессорах – отказ от использования токсичных реагентов без потери качества проводки материала). Существенный недостаток – значительно бóльшая стоимость этих технологий. Из наиболее доступных заменителей ксилола для гистологической проводки можно рекомендовать высокоочищенный изопропиловый спирт (изопропанол) с концентрацией основного вещества не менее 99,5%, в котором осуществляются все этапы дегидратации и пропитки до парафина – таким образом, из использования исключаются те только ксилол, но и этанол.
17. Не рекомендуется запускать в одной серии проводки разнородный тканевой материал. Предпочтительно мелкие биопсии (гастробиопсии, пункционные биопсии) запускать в проводку отдельно, например, от операционного материала, или от тканей, содержащих много жидкой крови (соскобы эндометрия) или жира (кожа, липомы). В учреждениях с большими объемами разнородного материала всегда следует разделять потоки разнородного материала, основываясь на особенностях, могущих оказать влияние на качество проводки тканей. Понятно, что программы проводки также следует адаптировать отдельно для каждого вида тканей – только тогда можно рассчитывать на стабильно хорошее качество препаратов.
Унифицированная процедура проводки
1. Унификация процедуры проводки определяется выбранной программой проводки. Подбор адекватной программы для каждого типа материала, с учетом пробных проводок, может занять достаточно продолжительное время, но потраченные усилия обеспечат стабильность работы лаборатории на длительную перспективу.
2. Реагенты для проводки необходимо заменять в четком соответствии с протоколом. Предпочтительно использование системы контроля за реагентами, применяемой в современных гистологических процессорах.
Заливка
Выбор оборудования для заливки[34]
Заливочные станции предназначены для заливки материала в парафин и изготовления парафиновых блоков. Это оборудование существенно облегчает технологию заливки, исключает использование спиртовок, существенно сокращает затраты рабочего времени. Все имеющиеся на рынке приборы характеризуются принципиально похожим техническим решением – оснащены емкостями для парафина, функцией автоматической подачи парафина, горячими камерами для содержания заливочных форм и кассет с материалом, горячими и охлаждаемыми рабочими поверхностями.
Основные представленные на рынке приборы – это Leica EG1160 (Germany), Microm EC350 (Germany), Sakura TEC5 (Japan) и Shandon Histocentre 3 (United Kindom). При сравнении основных технологических параметров приборов существенных, с точки зрения пользователя, различий не обнаруживается.
Различия объемов отсеков для парафина от 3 л до 5 л, даже при больших заливках, не имеет особого значения, ибо чаще всего для одного сеанса работы хватает уже и 3 л.
В приборе Leica EG1160 для подачи парафина используется электромеханическая помпа, тогда как в сравниваемых образцах Microm EC350, Sakura TEC5 и Shandon Histocentre 3 подача парафина обеспечивается созданием избыточного давления в камере.
Различия вместимости охлаждающей панели также представляются нам не существенными. Единственное, пожалуй, принципиальное отличие технических решений Microm EC350, Sakura TEC5 и Shandon Histocentre 3 от Leica EG1160 состоит в применении двухмодульной конструкции, позволяющей модифицировать рабочее место по желанию пользователя.
Однако, справедливости ради, следует отметить, что в приборной линейке Leica имеются и модульные решения заливочных станций – такие как EG1150 – они, разумеется, имеют более простую конструкцию и характеризуются существенно меньшей стоимостью.
Общие рекомендации по процедуре заливки
1. Во избежание путаницы следует всегда производить одновременную заливку в блок только одного образца из одной кассеты. Не следует одновременно вскрывать несколько кассет при процедуре заливки.
2. Не следует в один блок заливать кусочки из нескольких кассет. Не следует в один блок заливать несколько кусочков, даже если они проводились в одной кассете. Всегда рекомендуется следовать правилу – в один блок следует заливать только один кусочек, на один блок следует наносить только один уникальный регистрационный номер, соответствующий номеру кусочка.
3. Всегда перед заливкой следует проверить четкость маркировки блока (основание кассеты или заливочное кольцо) и ее соответствие маркировки кассеты.
4. Заливочные формочки следует подбирать сообразно размерам тканевых образцов. Не следует использовать для всех образцов одинаковые заливочные формочки. При использовании крупных формочек для мелких образцов на поверхности блока, предназначенной для реза, остается широкая полоса пустого парафина, не содержащего ткани, что значительно увеличивает площадь среза. Чем больше площадь среза, тем сложнее получить равномерно тонкий качественный срез. В таких ситуациях площадь поверхности среза обычно уменьшают путем ручной обрезки излишков парафина вокруг кусочка, что является непроизводительными тратами времени.
5. Все манипуляции с образцами выполняются аккуратно. При заливке образцы не следует с силой придавливать ко дну заливочной формочки – некоторые образцы, деформировавшиеся на предыдущих этапах обработки, при этом могут быть сломаны.
6. Образцы следует переносить из кассет в заливочные формы параллельно – то есть той же поверхностью вниз, как они лежат и в кассетах. Таким образом, поверхность, выбранная для среза врачом во время вырезки, всегда попадет на вершину парафинового блока. Неплотное прилегание кусочка к поверхности реза в блоке увеличивает количество «пустого» парафина, который при микротомии приходится срезать – это увеличивает время процедуры микротомии, вызывает дополнительный износ микротомных лезвий и увеличивает площадь среза.
7. Если образец имеет вытянутую форму – его следует ориентировать по длинной оси заливочной формы, чтобы при микротомии рез приходился по малой стороне кусочка.
8. Температуру горячей части заливочного комплекса и резервуара с парафином рекомендуется проверять регулярно. Если температура горячей части заливочного комплекса и резервуара с парафином превышает температуру плавления парафина, то и на этой стадии обработки образец может быть поврежден воздействием высокой температуры. Локальные термические повреждения кусочков возможны при их контакте с раскаленными браншами щипцов с помощью которых производится заливка материала. Перегрев инструментов выше температуры плавления парафина при заливке возможен при использовании спиртовки, как это обычно бывает в процедуре ручной заливки. Щипцы, с помощью которых производится перенос материала из кассет и ориентация образцов в заливочной форме следует нагревать не более чем до температуры плавления парафина. Современные заливочные станции оснащены специальными гнездами для нагрева браншей пинцетов, причем температура нагрева в них соответствует температуре парафинового танка. Термические повреждения образцов возможны и за счет перегрева горячей части заливочного комплекса и резервуара с парафином выше температуры плавления парафина. Перегрев инструментов при заливке возможен при использовании спиртовки, как это обычно бывает в процедуре ручной заливки. Если щипцы, с помощью которых производится заливка материала, нагреваются до температуры большей, чем температура плавления парафина – это может приводить к локальным термическим повреждениям ткани в области контакта с раскаленными щипцами.
9. Избыточное количество парафина вызывает его затекание между кассетой и формой. Потеки парафина вокруг блока требуют обрезания его по краям, кассеты не плотно фиксируются в микротоме, что приводит к нестабильности блока и возможности повреждения образца при микротомии. Иногда при обрезании избытков парафина могут быть утрачены некоторые элементы маркировки блока. Кроме того, обрезание излишков парафина вокруг блоков являются непроизводительными тратами времени. В заливочную формочку следует наливать ровно столько парафина, чтобы заполнить ее до краев.
10. Парафин следует наливать в хорошо прогретую заливочную форму, иначе он преждевременно застынет, что влечет за собой неравномерное застывание парафина в блоке, появление трещин в толще блока и в окружности кусочка. При появлении таких дефектов блок надо перезалить. Если этот дефект обнаруживается во время микротомии следует заливочную форму с кусочком на некоторое время оставить на горячей плате заливочного комплекса до полного расплавления парафинового ореола, и только после этого продолжить монтаж основания блока. Если кусочек при переносе из кассеты в заливочную форму долго находится на воздухе, парафин на его поверхности застывает, и при перемещении в парафин не успевает полностью расплавиться. В результате, вокруг кусочка формируется зона неравномерного застывания парафина в виде мутного ореола с трещинами. Во время микротомии нередко кусочки из таких блоков выкрашиваются и выпадают при ударе о нож. При появлении таких дефектов блок надо перезалить. Если этот дефект обнаруживается во время микротомии следует заливочную форму с кусочком на некоторое время оставить на горячей плате заливочного комплекса до полного расплавления парафинового ореола, и только после этого продолжить монтаж основания блока.
Унифицированная процедура заливки
1. Выбрать заливочную форму, соответствующую по размеру кусочку (рис. 23). Для заливки следует использовать чистые, насухо протертые заливочные формы, не содержащие остатков парафина от предыдущих заливок.
2. Поместить заливочную форму на горячей поверхности заливочного комплекса и прогреть ее до температуры плавления парафина.
3. Налить парафин в заливочную форму так, чтобы заполнить только углубление для кусочка. При этом парафин должен оставаться расплавленным, Если по краям или днищу формы появляются белесоватые фокусы застывания парафина – значит форма недостаточно прогрета, и ее следует оставить на горячей поверхности до тех пор, пока весь налитый в нее парафин ни расплавится полностью.
4. Извлечь одну кассету с материалом из горячей емкости для кассет и разместить ее основанием вниз на горячей поверхности.
5. Открыть кассету, и крышку выбросить в рядом стоящий лоток.
6. Аккуратно приподнять верхнюю прокладку и перевернуть ее, проверить – не прилипли ли к прокладке мелкие кусочки материала. При этом следует проверить соответствие фактического числа кусочков, находящихся в кассете, маркировке. Если к внутренней стороне прокладке прилипли мелкие кусочки материала из кассеты, ее следует перевернуть кусочками кверху и разместить на горячей поверхности радом с открытой кассетой. Если на верхней прокладке кусочков не обнаруживается – тогда ее можно выбросить в рядом стоящий лоток, но обязательно внутренней поверхностью вверх. Лоток для отработанных прокладок должен быть отдельным, отработанные прокладки следует складывать по порядку, чтобы всегда можно было бы восстановить какая прокладка относится к какой кассете на случай, если потеряется один из кусочков.
7. Осторожно, горячим пинцетом, извлечь из кассеты кусочки вместе с нижней прокладкой, и разместить её на горячей поверхности рядом с открытой кассетой.
8. Подготовить основание для блока и проверить его маркировку. В один блок следует заливать только один кусочек (рис. 24). Заливка нескольких тканевых образцов в один парафиновый блок (рис. 25) не допускается, за исключением случаев соскобов, эндоскопических резекций и работ по технологии microarrays. Потому, если в кассете осуществлялась проводка нескольких кусочков – следует приготовить основания для блоков по количеству кусочков, находящихся в кассете. В качестве основания блока можно использовать как основания кассет, так и заливочные кольца (рис. 26). Перед монтажом блока основание также следует держать нижней поверхностью на горячей поверхности прибора.
9. Проверить маркировку приготовленных оснований блоков – каждый блок должен быть маркирован уникальным номером, соответствующим номеру залитого в него образца.
10. Осторожно, горячим пинцетом, взять кусочек и аккуратно перенести его в заливочную форму с расплавленным парафином (см. пункт 3), стараясь как можно меньшее время держать его на открытом воздухе.
11. Кусочек следует переносить параллельно, максимально сохраняя его расположение в кассете, обращая особое внимание на то, что поверхность кусочка, располагавшаяся на дне кассеты, должна оказаться и на дне заливочной формы.
12. Предпочтительно ориентировать кусочек по центру углубления и по длине заливочной формы.
13. Все манипуляции с кусочком в заливочной форме следует производить горячим пинцетом, не допуская даже частичного застывания парафина. Если кусочек имеет малые размеры и может быть сдвинут струей парафина при заполнении блока – его можно зафиксировать к днищу заливочной формы легким подмораживанием, для чего форму на одну (не более) секунду можно переместить на холодную поверхность заливочного комплекса.
14. Установить основание блока сверху заливочной формы так, чтобы верхняя кромка залитого в него парафина покрывала пластиковую решетку основания.
15. Зафиксировать основание блока в заливочной форме можно переместив форму на одну (не более) секунду на холодную поверхность заливочного комплекса. Это также позволит подморозить края прилегания основания к металлической заливочной форме и предотвратить вытекание парафина из блока до его застывания.
16. Заполнить расплавленным парафином основание блока до 3/4 объема внутренней полости и переместить блок на холодную поверхность прибора.
17. Дождаться полного застывания парафина. Заливочные формы должны отделяться от застывшего блока легко, без усилий.
Критерии качества парафинового блока
1. Парафиновый блок должен иметь гладкую поверхность без выщербин и прочих дефектов.
2. Кусочек в блоке должен быть расположен максимально близко к поверхности реза, и возможно более точно к середине площадки. При продолговатой форме кусочка, он должен быть ориентирован по длиннику блока.
3. Застывший парафин в блоке должен иметь однородный вид, без трещин, пузырей, зон уплотнений и разрежений. Особо следует обращать внимание на отсутствие трещин или белесоватых ореолов вокруг кусочка в блоке.
4. Блок должен иметь достаточно много парафина в основании, чтобы не отломиться под ударом ножа при микротомии.
5. На блоке не должно быть посторонних потеков парафина за пределами основания или заданной формы. При наличии таких потеков их следует аккуратно срезать.
6. Маркировка блока должна быть четкой и хорошо различимой, не смазанной и не залитой парафином.
Микротомия
Выбор оборудования для микротомии[35]
Для изготовления парафиновых срезов используются специальные приборы – микротомы. Существует два принципиально отличных технических решения в конструкции этих приборов: так называемый «санный» микротом – ручное горизонтальное перемещение ножа, механическая винтовая подача образца, использование многоразовых микротомных ножей; «ротационный» микротом – ротационная ручная или механизированная подача образца на жестко закрепленный нож, возможность использования одноразовых лезвий, ретракция, различные варианты автоматизации. Ротационные механизмы используются и в конструкции современных криомикротомов.
Механические ротационные микротомы на рынке представлены моделями Leica RM2125 (Germany), Leica RM2235 (Germany), Microm HM325 (Germany), Sakura SRM200 (Japan) и Shandon FINESSE 325 (United Kindom). Промежуточное положение занимают не полностью моторизованные ротационные микротомы типа Leica RM2245 (Germany). Полностью автоматизированные роторные микротомы на рынке представлены моделями Leica RM2255 (Germany), Leica RM2265 (Germany), Microm HM350 (Germany), Microm HM355 (Germany) и Shandon FINESSE ME+ (United Kindom).
Санные микротомы являются самыми простыми приборами, с весьма ограниченными техническими и функциональными возможностями.
В группе механических ротационных микротомов на рынке представлены следующие модели: Leica RM2125 (Germany), Microm HM325 (Germany), Sakura SRM200 (Japan) и Shandon FINESSE 325 (United Kindom).
Приборы Leica RM2125 и Sakura SRM200 имеют диапазон устанавливаемой пользователем толщины срезов от 0,5 мкм до 60 мкм, и тримминг от 10 мкм до 50 мкм. Microm HM325 характеризуется более широким диапазоном регулировки толщины срезов (0,5-100 мкм), но более узким диапазоном тримминга (10-30 мкм) и Shandon FINESSE 325 характеризуется минимальным диапазоном регулировки толщины срезов (1-30 мкм).
Величина ретракции образца в приборах Leica RM2125 и Sakura SRM200 имеет сравнимую величину (соответственно 200 мкм и 220 мкм), что в 4000 раз превышает наиболее часто используемую толщину срезов (0,5 мкм), и более чем в 3 раза превышает максимально возможную толщину среза. Величина ретракции в Microm HM325 составляет 60 мкм, что лишь в 120 раз превышает наиболее часто используемую толщину срезов (120х0,5 мкм = 60 мкм), и даже меньше максимально возможной толщины среза.
Величина горизонтального смещения образца в моделях Leica RM2125, Microm HM325, Sakura SRM200 имеет сравнимую величину, хотя увеличение этого параметра на 2 мм в Leica RM2125 создает условия для лучшей функциональности этой модели при работе с малыми образцами, поперечный размер которых меньше 2 мм. Следует, однако, заметить, что меньший диапазон поперечного смещения образца в Sakura SRM200 полностью компенсируется возможностью поперечного смещения ножа. Отсутствие же функции поперечного смещения ножа в Microm HM325 в сочетании с меньшей величиной горизонтального смещения образца существенно снижает функциональность прибора, особенно при работе с малыми образцами. Shandon FINESSE 325 характеризуется минимальной в сравниваемом ряду приборов величиной возможного горизонтального смещения образца при отсутствии функции поперечного смещения ножа. Величина вертикального смещения образца во всех описываемых моделях имеет сравнимую величину, а имеющиеся отличия не оказывают влияния на функциональность приборов.
Наличие в Microm HM325 счетчика срезов создает дополнительное удобство при работе и позволяет объективно оценить нагрузку на прибор.
Следует отметить, что в линейке механических ротационных микротомов, выпускаемых Leica (Germany), имеется более продвинутая модель Leica RM2235, существенно отличающаяся от описанных выше моделей, и потому из этого сравнительного ряда исключенная.
В группе автоматизированных ротационных микротомов на рынке представлены следующие модели: Leica RM2255 (Germany), Microm HM350 (Germany), Microm HM355 (Germany) и Shandon FINESSE ME+ (United Kindom).
Все представленные приборы характеризуются высокой производительностью за счет широкого спектра моторизованных функций и отличным качеством приготовления срезов. Основными техническими особенностями, выгодно отличающими модель Leica RM2255 от аналогов являются наличие функции ретракции без полного оборота ротора, более широкий диапазон тримминга, более удобная конфигурация информационных дисплеев и органов управления.
Следует отметить, что в линейке автоматизированных ротационных микротомов, выпускаемых Leica (Germany), имеется более продвинутая модель Leica RM2265, существенно отличающаяся от описанных выше моделей, и потому из этого сравнительного ряда исключенная.
Общие рекомендации по процедуре микротомии
1. Для микротомии всегда следует использовать острые лезвия высокого качества. Не следует использовать лезвия до появления полос на срезе. Борозды на препарате чаще всего являются результатом повреждения материала ножом при микротомии. Следы от ножа могут просматриваться по всей поверхности среза, но чаще выявляются в виде единичных борозд, идущих по направлению хода ножа. Грубые борозды хорошо видны макроскопически. Поверхность ножа может иметь зазубрены, быть недостаточно заточенной или поврежденной в процессе работы (после контакта с металлическими инструментами или при резке плотной ткани, содержащей участки кальцификации).
2. При использованием тупых ножей, грубой микротомии с применением слишком мягких заливочных сред может произойти смещение костных балок, коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон, что обусловлено изменением их направления и механической ориентацией по ходу ножа.
3. Угол наклона ножа настраивается отдельно для каждого микротома, вида ножа и плотности блока. Если угол наклона ножа не изменяется в зависимости от изменения условий – другой микротом, другой тип ножа, другой парафин – это приводит к снижению качества срезов.
4. Появление тонких параллельных разрывов препарата обычно объясняется нестабильным положением ножа при микротомии плотных образцов тканей. В большинстве случаев это связано с недостаточной фиксацией лезвия в микротоме.
5. Кроме того, чрезмерная ломкость материала может быть обусловлена высушиванием образца при проводке или чрезмерным охлаждением кусочка при приготовлении замороженных срезов.
6. Грубые вибрационные повреждения материала возникают в первую очередь при обработке больших кусков плотных тканей (чаще всего, препараты шейки и тела матки), при плохом закреплении ножа микротома или образца в держателе. В ряде случаев причиной вибрационных повреждений могут быть технические характеристики микротома.
7. В качестве подготовки к микротомии с поверхности реза блока необходимо удалить лишний парафин, выровнять ее таким образом, чтобы в срез попадала максимальная площадь кусочка, а также отполировать. Подрезку (тримминг) блоков следует производить бережно, чтобы не утратить важные фрагменты ткани. Для полировки поверхности блока толщину последних нескольких срезов тримминга всегда следует делать равной конечной толщине среза. Если для ускорения процесса блоки подрезаются не аккуратно (высокая скорость, очень большая величина подачи), поверхность не полируется перед изготовлением финальных срезов – это приводит к формированию большого количества рваных дефектов ткани, в срезе похожих на дырки "проеденные молью".
8. Если кусочек залит в блок таким образом, что прилежит к плоскости реза не ровной (изогнутой, деформированной) поверхностью, при попытке добиться максимальной площади ткани в срезе можно при тримминге срезать критически большой объем кусочка, или вовсе утратить объект. В таких случаях блок лучше перезалить, и при перезаливке постараться, насколько это возможно, более плотно прижать кусочек к дну заливочной формы.
9. Перед микротомией блоки следует охлаждать так как они всегда должны быть холодными во время резки. Чем холоднее блок, тем плотнее парафин, и тем проще будет получить тонкие срезы. Если для микротомии используются неохлажденные блоки – это приводит к сильной деформации кусочка при резке. Считается, что идеальна для охлаждения блоков температура «талого льда». Традиционно лаборанты используют для охлаждения блоков перед микротомией пластиковые емкости со льдом. Это не очень технологично, так как на поверхности льда помещается не много блоков, он быстро подтаивает, и емкости приходится часто менять, для чего необходимо отрываться от рабочего места, чтобы подойти к холодильнику.
10. Рядом фирм, специализирующихся на выпуске медицинского лабораторного оборудования, производятся настольные морозильные камеры малых размеров с горизонтально расположенной морозильной камерой, вместимостью до 200 блоков. Этот прибор удобно размещается на рабочем месте (рис. 27) рядом с микротомом, и избавляет лаборанта от непроизводственных потерь времени.
11. Надо помнить, что блоки перед микротомией не следует сильно замораживать – это может привести к появлению трещин в парафине, особенно по краю залитого кусочка, в виде белесоватого ореола. Качественный парафиновый блок не должен растрескиваться при охлаждении до –20ºС. При появлении трещин в блоках при температурах в указанном пределе следует обратить внимание на качество используемого парафина.
12. При микротомии следует устанавливать малую скорость реза. При высокой скорости реза в момент удара ножа о край блока, из него выколачиваются мелкие зерна парафина, из-за чего в срезе появляются рваные дефекты в виде выщербин или полос. В таких случаях поверхность реза следует заново отполировать ножом, чтобы в дальнейшем получить нормальные срезы.
13. Если в лаборатории традиционно используются адгезивные средства, добавляемую во флотационную жидкость, то существует опасность отложений избытков адгезива на срезах. Адгезивы могут откладываться на срезах в виде аморфных слабо базофильных гомогенных масс в результате вымывания или испарения флотационной жидкости. Отложению адгезивов на срезах могут способствовать неоднородная структура тканей (легкое), низкое качество срезов и использование адгезивов, которые плохо стекают с предметного стекла. Не следует помещать на плитку для высушивания стекла, содержащие избыток раствора адгезива.
14. Использование тонких (3-5 мкм) срезов и высококачественных предметных стекол с идеально ровной гладкой поверхностью обеспечивает надежное прилипание тонких срезов к стеклу за счет сил поверхностного натяжения и, таким образом, исключает необходимость применения адгезивных средств при большинстве гистологических окрасок, не предполагающих термической обработки срезов.
15. Пузырьки воздуха могут образоваться под срезом при его помещении во флотационную ёмкость. Если пузырьки сохраняются под срезом при переносе его на предметное стекло, они препятствуют плотной его адгезии, и в этих участках при высушивании образуются округлой или овальной формы мелкие дефекты в виде трещин и разрывов, выявляемые при микроскопии. Чаще всего это связано с нарушениями техники монтирования среза на предметное стекло. Самой частой ошибкой является захват и подведение пузырьков воздуха под срез предметным стеклом. Правильной тактикой является натягивание среза на стекло, расположенное под углом к поверхности воды. Для уменьшения количества пузырьков воздуха во флотационную ёмкость рекомендуется заливать свежекипячёную воду с минимальным содержанием растворенных газов.
16. Загрязнения микропрепаратов фрагментами плоского эпителия встречается не редко и связаны с попаданием на срез чешуек кожи пальцев, перхоти или эпителия слизистых оболочек носоглотки и ротовой полости при чихании и кашле. Лаборантов следует предупредить о соблюдении элементарных гигиенических мер, направленных на исключение такого рода контаминаций, и строго за это спрашивать. За кожей рук необходимо ухаживать с использованием питательных и увлажняющих кремов и смазок, волосы необходимо полностью убирать под медицинские шапочки, для исключения распыления слюны следует использовать медицинские маски. Никогда не следует прикасаться руками ни к срезам, ни к поверхности предметных стекол – все манипуляции со срезами необходимо производить лишь с использованием кисточек и специальных инструментов, а предметные стекла можно брать рукой только за ребра по краям матовой полосы для записи.
17. Хрящевая ткань одна из наиболее сложных для обработки, так как препараты плохо расправляются. Избежать складок в материале помогает применение специальных техник обработки: пропитывание в целлоидин-парафиновых смесях (double-embedding) или заливка в смолы. Образование складок связано в первую очередь с тем, что хрящевая ткань в процессе проводки сильно ссыхается и лишь частично расправляется при флотации.
18. Смонтированные срезы, оставленные неокрашенными на длительный срок на открытом воздухе, могут быть загрязнены различными агентами, например: микроорганизмами, особенно аэробными грибами, взвешенными в воздухе частицами, волосками от кисточки, при переносе среза с лезвия в ванночку, частицами целлюлозы с салфеток, используемых для очистки ванночки или покровных стекол, пылью. Желательно свежеприготовленные срезы перед окраской высушивать в закрытых контейнерах. Срезы, которые предполагается хранить некоторое время неокрашенными рекомендуется содержать в закрытых контейнерах. Кроме того, стекла необходимо тщательно промывать перед процедурой окрашивания.
19. Воду в емкости для флотации (водяная баня) следует заменять так часто как это возможно. Если вода в емкости заменяется редко, а только добавляется, то на срез могут попасть различные загрязняющие агенты, такие как споры грибов или фрагменты срезов с других блоков. Если поверхность воды во флотационной емкости не очищается после каждого блока – это может привести к попаданию частичек одного препарата на другой и быть причиной диагностических ошибок. Перед микротомией каждого нового блока следует тщательно очищать поверхность воды от мелких остатков срезов с предыдущего блока. Микротомию разнородного материала следует производить на разных микротомах, или полностью менять воду в водяной бане перед началом работы. Часто на поверхности воды остаются мелкие фрагменты срезов от абортного материала (мелкие ворсины) – потому этот материал следует направлять на микротомию либо на отдельное рабочее место, либо последним в течение рабочего дня.
20. Для расправления срезов в водяной бане рекомендуется всегда использовать свежеприготовленную дистиллированную воду – это гарантирует избавления от избытков солей и механических примесей.
21. Перед использованием всегда следует проверять чистоту предметных стекол. Предметные стекла следует готовить для размещения на них срезов непосредственно перед микротомией и в количестве, необходимом для изготовления требуемого числа препаратов. Нельзя раскладывать стекла заранее и оставлять их лежать на воздухе длительное время. Прикосновение к стеклам руками необходимо исключить, или свести к минимуму, чтобы предотвратить загрязнение их чешуйками плоского эпителия кожи рук. Никогда не следует прикасаться руками к поверхности предметных стекол, предметные стекла можно брать рукой только за ребра по краям матовой полосы для записи. Если чистота предметных стекол не контролируется, на них попадают частички грязи и микроорганизмы, которые портят даже хороший микропрепарат.
22. Для гистологических микропрепаратов предпочтительно выбирать предметные стекла, изготовленные из нейтрального стекла, толщиной не более 1,0 мм, бесцветные, с идеально ровной и гладкой поверхностью и матовой полосой для записи. Наличие шлифованного края существенно увеличивает стоимость стекла. Вместе с тем, стекла с нешлифованным краем, особенно при неосторожном обращении, дают много мелких осколков на предметном столе микроскопа, фронтальной линзе конденсора и приводе препаратоводителя. Очень важно проследить точность линейных размеров предметного стекла. В некоторых случаях, особенно это характерно для менее качественных и недорогих стекол, ширина стекол варьирует даже в пределах одной партии более чем на 1,0 мм. Это может оказаться критичным в случае если в лаборатории используются автоматы для заключения срезов под покровное стекло – эти приборы очень чувствительны к изменению ширины предметных стекол. Как правило, высококачественные предметные стекла для гистологии (Menzel, TermoShandon и другие) поступают к конечному потребителю готовыми к употреблению, и не требуют дополнительной чистки и обезжиривания.
23. Срезы более чем с одного блока не должны находиться вместе во флотационной емкости. Не следует оставлять во флотационной емкости срезы с двух или нескольких блоков – это может привести к неверной идентификации образцов. Особенно высок такой риск, когда одновременно обрабатываются ткани одного типа.
24. Температуру воды во флотационной емкости следует тщательно контролировать. Оптимальна температура – на 4-5ºС ниже температуры плавления парафина – то есть 51-52ºС. При такой температуре срезы быстро расправляются, но парафин не плавится. Парафин срезов никогда не должен плавиться на поверхности водяной бани. Если срезы оставляются на водяной бане более 15 минут или если парафин срезов плавится, происходит перерастяжение среза, за счет чего формируются повреждения и разрушения ткани среза в виде разрывов.
25. Качественные срезы при помещении во флотационную емкость должны быстро расправляться без образования складок. Если срезы полностью не расправляются, причиной этому может служить слишком холодная вода во флотационной емкости или слишком большая толщина срезов.
26. Расправление складок на срезах с помощью щеточки или щипцов следует выполнять лишь в исключительных случаях и чрезвычайно аккуратно, чтобы не повредить срез. Если расправление складок на срезах с помощью щеточки или щипцов выполняется энергичными движениями, возникают макро- и микроскопические повреждения срезов.
27. Никогда не следует переносить на стекло первый и второй срезы из серии. Первый и второй срезы выглядят лучше, поскольку они всегда толще из-за теплового расширения холодного блока при первом прохождении ножа.
28. Любые видимые пузырьки воздуха плавающие на поверхности флотационной жидкости следует удалять до того, как срезы помещаются в воду. Пузырьки воздуха могут образоваться под срезом и при его помещении во флотационную ёмкость. Если пузырьки сохраняются под срезом при переносе его на предметное стекло, они препятствуют плотной его адгезии, и в этих участках при высушивании образуются округлой или овальной формы мелкие дефекты в виде трещин и разрывов, выявляемые при микроскопии. Чаще всего это связано с нарушениями техники монтирования среза на предметное стекло. Самой частой ошибкой является захват и подведение пузырьков воздуха под срез предметным стеклом. Правильной тактикой является натягивание среза на стекло, расположенное под углом к поверхности воды. Пузырьки, попадающие под срез исчезают при его высыхании, но несмотря на это, область среза над пузырьком часто разрушается и может быть утрачена. Для уменьшения количества пузырьков воздуха во флотационную ёмкость рекомендуется заливать свежекипячёную воду с минимальным содержанием растворенных газов.
29. Отклеивание срезов от предметного стекла может происходить при подготовке к окраске и во время процедуры окрашивания. Это может быть связано с недостаточным прилипанием срезов к предметному стеклу. Наиболее частыми причинами являются недостаточное высушивание срезов после микротомии, или толстые срезы или использование некачественных предметных стекол с неровной поверхностью.
30. Отклеивание срезов от предметного стекла может происходить и при процедуре термической обработки срезов, требуемых для некоторых вариантов окрасок (демаскировки антигена перед иммуногистохимическим окрашиванием). В таких случаях следует использовать коммерческие предметные стекла со специальным адгезивным покрытием. Использование технологий ручного покрытия предметных стекол специальными адгезивами (AAS) не желательно, так как может повлечь за собой появление специфических артефактов.
31. Использование тонких (3-5 мкм) срезов и высококачественных предметных стекол с идеально ровной гладкой поверхностью обеспечивает надежное прилипание тонких срезов к стеклу за счет сил поверхностного натяжения и, таким образом, исключает необходимость применения адгезивных средств при большинстве гистологических окрасок, не предполагающих термической обработки срезов.
32. Перед переносом стекол на сушку с них необходимо удалить избыток воды в вертикальном положении путем стекания и промакивания. Если стекло нормально обезжирено и не загрязнено, то избыток флотационной жидкости легко стекает с его поверхности. Если вода не удаляется со стекла перед сушкой, это может привести к деформации срезов, связанной с различной теплоемкостью стекла, воды и парафина.
33. Предпочтительно сушить срезы в решетках для окраски в вертикальном положении, и при комнатной температуре. Это существенно уменьшит оседание на поверхность предметного стекла частичек пыли из окружающего воздуха, и исключит термические повреждения срезов.
34. Высушивание срезов на нагревательных плитках может быть причиной появления деформаций, перерастяжений и разрывов срезов, связанных с различной теплоемкостью стекла, воды и парафина, и так называемых «тепловых пятен» (участков неравномерного окрашивания препарата), связанных с плавлением парафина и пережиганием самого тканевого среза.
Унифицированная процедура микротомии
1. Поместить блоки, приготовленные для микротомии, в холодильник, или в охлаждающий модуль, или на поверхность льда для охлаждения.
2. Закрепить лезвие в держателе ножа микротома, и максимально отвести держатель ножа от объектодержателя. Установить требуемый угол наклона ножа, и надежно закрепить все крепежные винты узла держателя ножа.
3. Вставить блок в объектодержатель. Блок должен четко подходить к крепежным элементам объектодержателя специальными выступами. Если на основании блока имеются потеки излишнего парафина, мешающие его правильному расположению в держателе – их следует удалить. Следует также обратить внимание, чтоб поверхность блока была не блажной и не содержала замерзших капель воды.
4. Осторожно подвести блок держателя ножа к блоку, в непосредственной близости ножа к поверхности реза блока перейти к режиму механической подачи до появления первого среза парафина.
5. Выполнить подрезку блока в режиме тримминга до получения максимальной площади среза тканевого образца, причем, для окончательной полировки поверхности реза, толщина последних 2-3 срезов при тримминге не должна превышать 3-5 мкм.
6. Проверить очищена ли от остатков срезов с предыдущего блока поверхность флотационной жидкости в водяной бане.
7. Приготовить и промаркировать необходимое количество предметных стекол, исходя из количества окрасок, назначенных для данного блока.
8. Приступить к штатной микротомии. При нормальном качестве фиксации, проводки и заливки современные ротационные микротомы позволяют на валовом материале изготавливать парафиновые срезы стандартно толщиной не более 3 мкм.
9. Изготовить серию из нескольких последовательно получаемых срезов, слегка придерживая ленту за первый срез.
10. Перенести ленту срезов на поверхность флотационной жидкости в водяную баню для расправления.
11. Выбрать срезы, пригодные для изготовления микропрепаратов. Никогда не следует выбирать первый и второй срезы – они всегда толще остальных срезов в серии из-за теплового расширения парафина на поверхности блока.
12. Перенести отобранные срезы на заранее приготовленные и промаркированные предметные стекла, удалить излишки флотационной жидкости со стекол и поместить их на нагревательную плату для высушивания.
Окраска
Выбор оборудования для окраски препаратов[36]
Для автоматической окраски парафиновых срезов используются специальные приборы – автостейнеры. Это современные роботизированные системы окрашивания срезов на предметных стеклах для выполнения всех рутинных методов окрашивания. Принципиально важный результат внедрения технологий автоматизирования окрашивания микропрепаратов состоит в унификации условий окрашивания, что важно для получения сравнимых результатов, исключения лабораторных ошибок при резком увеличении производительности лаборатории.
Автостейнеры на рынке представлены моделями Leica ST5010 (Germany), Leica ST5020 (Germany), Microm HMS740 (Germany), Microm HMS760X (Germany), Sakura Prisma (Japan) и Shandon Varistain 24-4K (United Kindom). С целью соблюдения корректности из сравнительной характеристики исключены более продвинутые модели Leica ST5020 (Germany) и Microm HMS760X (Germany).
При сравнении, в первую очередь, обращает внимание различие грузоподъемности механической лапы – у Sakura Prisma и Shandon Varistain 24-4K этот параметр в 2 раза превышает соответствующие характеристики Leica ST5010 и Microm HMS740, что соответственно отражается на общей производительности приборов.
При этом, однако, объем реагентных емкостей Sakura Prisma и Shandon Varistain 24-4K более чем на 1/3 больше, что влечет за собой больший расход реагентов, и экономически оправдано только при очень больших объемах окраски микропрепаратов. При одинаковой величине загрузки (30 стекол) объем реагентных емкостей Microm HMS740 на 7% больше, чем у Leica ST5010, что отражает большую экономичность последнего.
Sakura Prisma и Shandon Varistain 24-4K имеют наибольшее количество станций для реагентов и станций загрузки. Явным преимуществом Leica ST5010 и Shandon Varistain 24-4K является большее число промывочных станций.
Leica ST5010 дает возможность одновременного выполнения до 15 программ окраски до 40 шагов каждая, в то время как Microm HMS740, Sakura Prisma при меньшем количестве программ (9 и 11 соответственно) дают возможность использовать до 50 шагов на каждую программу. Shandon Varistain 24-4K характеризуется наименьшим количеством протоколов окраски (3), в каждом из которых предусмотрено всего до 24 шагов, что более чем в два раза ухудшает функциональность прибора в сравнении с аналогами.
Временная шкала (предельное программируемое время на каждый шаг программы) у Leica ST5010 составляет 22 ч 59 мин 59 сек, что в 15 раз превышает соответствующие параметры Microm HMS740 и Sakura Prisma. Это может иметь большое технологическое значение при длительных (более 1,5 ч на один шаг) процедурах обработки микропрепаратов – при использовании Microm HMS740 и Sakura Prisma в таких случаях потребуется установка более чем одной станций с одноименным реагентом, что влечет за собой существенное увеличение их расхода.
Важная техническая особенность Leica ST5010, Sakura Prisma и Shandon Varistain 24-4K – возможность объединения, посредством станции переноса, с коверслипером в единый роботизированный комплекс, что обеспечивает большую функциональность и существенно расширяет технологические возможности приборов.
Общие рекомендации по процедуре окраски
1. Следует тщательно отслеживать продолжительность каждого этапа окраски. Если технологическая процедура окраски нарушается или пропускаются некоторые этапы, это приводит к получению несопоставимых препаратов. Оптимальным для обеспечения стандартизованной процедуры окрашивания является внедрение автоматов для окраски микропрепаратов (stainer).
2. Для контроля качества окраски рекомендуется постоянно изготавливать контрольные препараты. При отсутствии контроля окраски H&E становится невозможным определить причину плохого качества препаратов (например – некачественные реагенты, ошибки протокола, недостаточная фиксация и другие).
3. Условия окраски (такие как время окрашивания, перемешивания, промывки, сушки и другие) должны быть оптимизированы для каждого этапа. При неоптимизированной промывке и сушке реагенты в последующих емкостях быстро загрязняются, а нестандартизованная процедура перемешивания может повлиять на качество окраски ткани – качество окраски становится несопоставимым. Оптимальным для обеспечения стандартизованной процедуры окрашивания является внедрение автоматов для окраски микропрепаратов (stainer).
4. При подготовке срезов к окраске необходимо всегда добиваться полной депарафинизации препаратов. При неполной депарафинизации препаратов на стеклах остаются участки парафина, обусловливающие их гидрофобность по отношению к водным растворам красителей. В результате в препаратах появляются неокрашенные или неравномерно окрашенные участков срезов. Для исправления дефекта можно попробовать отмыть краску, заново довести препарат до этапа депарафинизации, а затем повторить процедуру окрашивания.
5. Реагенты следует регулярно менять в зависимости от числа окрашенных в них препаратов. Не следует дожидаться снижения качества окраски как повода для замены реагентов. Особенно тщательно надо следить за вспомогательными жидкостями – промывочными растворами, спиртовыми растворами, депарафинирующими реагентами.
6. Промывочную воду необходимо заменять на свежую перед окраской каждой новой партии препаратов независимо от того, насколько чистой она кажется глазу.
7. Спирты, используемые в процедуре окраски препаратов (гидратация перед окрашиванием и дегидратация перед заключением препаратов), должны сохранять характерный запах, быть прозрачными. Всегда следует заменить спирты перед окраской новой партии препаратов, если они имеют мутный вид. Наиболее быстро загрязняется емкость с 70% спиртом (последняя при гидратации и первая при дегидратации), при больших объемах материала его приходится менять чаще. Довольно быстро загрязняется и первая после ксилола спиртовая емкость (неразбавленный спирт) при процедуре гидратации. Очень важно для адекватной дегидратации срезов в последней перед заключением спиртовой емкости всегда иметь чистый неразбавленный спирт – потому ее тоже надо заменять довольно часто (обычно спиртовые емкости просто сдвигают на одну позицию назад). Не рекомендуется использовать для дегидратации перед заключением препаратов ту же батарею спиртовых емкостей, что использовалась для гидратации после депарафинирования.
8. Перед окрашиванием препараты следует тщательно отмыть от остатков ксилола и спиртов и довести до воды (гидратация). Не полностью отмытые от ксилола и спиртов препараты загрязняют раствор гематоксилина, что приводит к снижению качества окраски. Кроме того, не отмытые капли ксилола, несмешиваемого с водой, препятствуют контакту красителей со срезом, в результате чего на срезе могут остаться плохо прокрашенные участки, соответствующие по размерам этим каплям.
9. Характеристики раствора гематоксилина следует тщательно контролировать, так как в процессе работы гематоксилин значительно разбавляется водой со стекол и штативов и окисляется. Влиять на окисление гематоксилина могут площадь поверхности емкости, в которой он хранится, продолжительность доступа кислорода во время окрашивания и температура окружающей среды. Наиболее надежным признаком ухудшения качества гематоксилина является худшее прокрашивание ядер, снижение дифференцировки тонких ядерных структур – при появлении этих признаков раствор гематоксилина следует заменить на свежий.
10. После окраски гематоксилином для полного созревания следует использовать раствор Scott (щелочной заменитель водопроводной воды) или аммониевую воду (дистиллированная вода с несколькими каплями аммиака). Использование водопроводной воды, как это указано в классических руководствах, не рекомендуется, так как в наших конкретных условиях водопроводная вода далеко не всегда, как того требует протокол окраски, имеет слабощелочную реакцию, характеризуется разными показателями жесткости, часто содержит большое количество растворимых и нерастворимых примесей, влияние которых на качество окраски ни предсказать, ни нормировать не представляется возможным. Объем подщелачивания дистиллированной воды раствором аммиака зависит от свойств местной воды. Иногда ядра клеток выглядят розовыми из-за неполного созревания. Также розовыми будут ядра в препаратах недостаточно окрашенных гематоксилином или перекрашенных эозином.
11. После окраски гематоксилином и дифференцировки в щелочной воде следует тщательно отмыть щелочные агенты из препарата, ибо окраска эозином происходит в кислой среде и остатки щелочи могут ее ослабить. Неполное отмывание щелочных реагентов может привести к слабому или неравномерному окрашиванию препарата эозином, появлению на срезе потеков красителя.
12. Для оптимального окрашивания рН раствора эозина стабилизируют на значении около 5,0. Для подкисления раствора красителя используется уксусная кислота. Повышение рН раствора эозина вызывается загрязнением щелочной водой, используемой для созревания гематоксилиновой окраски ядер. Для уменьшения нейтрализующего влияния аммиачной воды можно добавить одну дополнительную промывочную емкость с чистой дистиллированной водой или 70% этанолом перед помещением препаратов в раствор эозина. Не следует дожидаться снижения качества окраски как повода для замены эозина.
13. Неравномерное окрашивание среза одним из красителей при сложных окрасках с использованием автостейнеров может быть обусловлено недостаточным наполнением реагентных ёмкостей.
14. Депозиты могут быть обусловлены нерастворенными частицами красителя или его преципитацией во время окраски. Преципитация возможна при испарении растворов красителей, например, при использовании методов, предусматривающих нагревание или длительное время окрашивания. Проблема усугубляется при окраске препаратов на открытых поверхностях. Использование стандартизованных ёмкостей для окрашивания, поддерживающих стекла в вертикальном положении, позволяет свести подобные артефакты к минимуму.
15. Микроорганизмы, загрязняющие растворы красителей, нередко осаждаются на препаратах. Во избежание этого артефакта рекомендуется своевременно менять красящие растворы или добавлять в них антибактериальные препараты, такие как тимол или метиолат. Если краситель поменять невозможно, фильтрация раствора позволит избавиться от этих загрязнений.
Заключение микропрепаратов под покровное стекло
Выбор оборудования для заключения препаратов[37]
Для автоматического заключения окрашенных срезов используются современные роботизированные системы заключения срезов на предметных стеклах. Существует два принципиально различных технических решения приборов этого типа – заключение окрашенного среза под покровное стекло с использованием специализированных гистологических монтирующих сред (традиционное техническое решение), и заключение окрашенного среза под специальную пленку без использования монтирующих сред (совместная разработка Sakura и FujiFilm).
Коверслиперы на основе традиционной технологии заключения среза под покровное стекло на рынке представлены моделями Leica CV5030 (Germany), Microm CTM6 (Germany), Sakura Glas (Japan) и Shandon Consul Automated Coverslipper (United Kindom).
Технология роботизированного заключения микропрепарата под покровное стекло во всех представленных приборах практически идентична, предполагает использование любых специализированных гистологических монтирующих сред и длинных покровных стекол (24х50/60 мм – так как при накрывании микропрепарата стекло захватывается двумя присосками и при покрывании подвергается изгибанию).
Принципиальным позитивным отличием Leica CV5030 является наличие технической возможности конфигурации его в единый роботизированный комплекс с автостейнерами Leica ST5010 (с использованием станции переноса Leica TS5015) или Leica ST5020 (с использованием станции переноса Leica TS5025) – при этом корзина с окрашенными стеклами автоматически переносится в коверслипер и после заключения выгружаются уже готовые микропрепараты.
При работе с Microm CTM6, Sakura Glas и Shandon Consul Automated Coverslipper перенос стекол из автостейнера в коверслипер осуществляется вручную.
При планировании приобретения этих приборов необходимо предусмотреть достаточное количество дополнительных контейнеров для выгрузки готовых микропрепаратов и специализированных гистологических монтирующих сред исходя из показателей производительности лаборатории.
Кроме того, при планировании текущего материально-технического обеспечения лаборатории важно иметь в виду, что с этими приборами возможно использование только покровных стекол размером 0,17х24х50 мм и предметных стекол размером 1,0х76х26 мм.
Важным преимуществом Leica CV5030 является возможность использования большинства представленных на рынке корзин для стекол, тогда как приборы Microm CTM6, Sakura Glas и Shandon Consul Automated Coverslipper используют только собственные корзины оригинальной конструкции.
Технология роботизированного заключения микропрепарата под специальную полимерную пленку FujiFilm реализована только в приборах Sakura Film (Japan) и Sakura SCA (Japan).
Эти приборы отличаются высокой производительностью, экономичностью (не требуют использования покровного стекла и специализированных гистологических монтирующих сред) и технологичностью (требуют меньше технологического ухода так как исключено использование монтирующих сред и их растворителей, исключены засоры трубок и игл, исключена операция прокачки монтирующей среды при каждом запуске прибора).
Однако, при этом затратная часть работ существенно не отличается. Принципиальным позитивным отличием Sakura Film является наличие технической возможности конфигурации его в единый роботизированный комплекс с автостейнером Sakura Prisma – при этом корзина с окрашенными стеклами автоматически переносится в коверслипер и после заключения выгружаются уже готовые микропрепараты.
При всех положительных свойствах описываемых приборов все же имеется один существенный недостаток. Поверхность микропрепарата, покрытого полимерной пленкой, в отличие от покровного стекла, никогда не бывает идеально ровной, и потому никогда не обеспечивается точное соблюдение важного для качественной микроскопии расстояния от поверхности предметного стекла до поверхности пленки (0,17-0,20 мм). Это может оказаться критичным при микроскопии высокого разрешения или при микрофотографировании, особенно с использованием современных высокочувствительных микроскопических цифровых камер.
Общие рекомендации по процедуре заключения срезов
1. Препараты следует полностью дегидратировать перед тем, как поместить в ксилол для просветления. Если препараты быстро проводятся через спирты, осветление в ксилоле, загрязненном водой, приводит к появлению микроскопических капель воды на поверхности препарата.
2. Ксилол для просветления должен быть всегда свежий, должен сохранять характерный запах, быть прозрачным. Примесь спирта и воды вызывает его помутнение. Всегда следует заменить ксилол перед окраской новой партии препаратов, если он имеет мутный вид. Наиболее быстро загрязняется первая емкость ксилола, следующая за спиртом, при больших объемах материала его приходится менять практически перед окраской каждой новой партии препаратов.
3. Покрытие препаратов покровными стеклами всегда следует осуществлять до того, как препарат успевает высохнуть. Если препараты частично высыхают перед накрытием покровными стеклами, некоторые ядра клеток становятся черными, или как бы обведенными темным контуром.
4. Желательно использовать гистологическую среду высокого качества. Следует иметь ввиду, что среды низкого качества при длительном хранении могут кристаллизоваться. Кристализованная гистологическая среда при длительном хранении может образовывать кристаллы и "поднимать" покровные стекла.
5. Разведение монтирующей среды ксилолом, как правило, не дает требуемого результата – через некоторое время среда под покровным стеклом все равно кристаллизуется, мутнеет.
6. Предпочтительно использовать высококачественную монтирующую среду, готовую к употреблению, и не требующую дополнительного разведения.
Дата добавления: 2019-02-22; просмотров: 1363; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!