Унифицированные требования по технологии
Макроскопического изучения и вырезки биопсийного
(операционного) материала
Общие рекомендации по процедуре макроскопического изучения
1. Характер, объем и степень необходимой детализации макроскопического описания определяется клиническими рекомендациями, а в неопределенных случаях – соображениями диагностической целесообразности, определяемыми врачом-патологоанатомом.
2. В любом макроскопическом описании должен содержаться минимально необходимый набор морфологических феноменов, наличие которых в описании, по своей совокупности, формально позволяет обосновать сформулированный далее диагноз (заключение).
5. Кроме предусмотренных стандартами описаний метрических и качественных характеристик патологического процесса, не следует пренебрегать детальным описанием зрительно доступных термических повреждений хирургического края удаленных фрагментов тканей, наличия шовного материала, участков механического (размозжение, дополнительные разрезы, проколы) и химического повреждения тканей, а также участков экзогенных пигментаций, попавших в макропрепарат.
6. Термические повреждения материала, часто обнаруживаемые в биопсиях, проявляются в виде коагуляционного некроза тканей. Термическое повреждение образца может быть следствием термического воздействия на любом этапе обработки, но наиболее часто – при термических воздействиях на нативную (нефиксированную) ткань, то есть при взятии материала вследствие ожога лазером, электрокоагулятором или при использовании других горячих инструментов. Частой причиной сгорания (обожжения) тканевого образца бывает использование завышенных более необходимого мощностей электрохирургических инструментов, применяемое при иссечении тканей в целях снижения кровоточивости в краях хирургической раны. Ширину зоны термического повреждения хирургического края образца должно отмечать в протоколе макро- и микроскопического описания.
|
|
|
7. Шовный материал может быть представлен в препарате как отдельными фрагментами, так и цельными волокнами, срезанными поперечно, продольно или косо. Шелковые хирургические нити дают выраженное двойное лучепреломление в поляризованном свете, что можно использовать как идентификационный признак данного вида материала. Шовный материал в кусочке может повредить нож микротома, что приведет к образованию полос на срезе при микротомии, потому видимые инородные структуры необходимо удалять из кусочка по возможности во время вырезки и соответствующим образом отражать в протоколе макроскопического описания.
|
|
|
8. Мягкие ткани могут быть легко повреждены при манипуляциях с использованием катетеров, как на нативном (нефиксированном) материале, так и на фиксированных тканевых образцах. Рекомендуется использовать все имеющиеся профессиональные и административные возможности противодействия любым манипуляциям с макропрепаратами операционного материала (дополнительные разрезы, проколы и прочие механические воздействия) в отсутствие врача-патологоанатома. Любые подобные действия, чем бы они ни были мотивированы, могут в значительной степени повредить материал, нарушить анатомические взаимоотношения тканей, вызвать раздавливание (размозжение) тканей, что, в свою очередь может осложнить дальнейшее микроскопическое изучение и интерпретацию полученных результатов исследования.
9. Нефиксированные ткани (особенно лимфатические узлы и селезенка) очень подвержены раздавливанию зажимами, пинцетами, другими инструментами или руками медицинского персонала. Следует помнить о необходимости минимизации любых механических воздействий на ткани как in vivo, так и на извлеченные тканевые образцы.
10. Следует строго следить за тем, чтобы макропрепараты операционного материала не подвергались воздействию никаких жидкостей, химических и физических агентов, кроме унифицированных растворов формалина[31], в который макропрепарат следует помещать тотчас после иссечения.
|
|
|
11. Дегенеративные изменения в тканях начинают развиваться сразу после прерывания кровотока. Аутолиз обусловлен воздействием гидролитических ферментов лизосом при нарушении внутренних мембран клеток. Признаки аутолиза могут быть в различной степени представлены в различных тканях, обычно бывают более выражены в эпителиальных тканях, чем в мезенхимных, что связано с большей устойчивостью последних к гипоксическим повреждениям (ранний признак аутолитических изменений тканей при отложенной фиксации – слущивание цилиндрических эпителиев выводных протоков желез, бронхов). В некоторых органах, таких как поджелудочная железа, процессы посмертного аутолиза более выражены из-за обилия протеолитических ферментов. В биопсийном материале, который обычно фиксируется немедленно, признаки аутолиза бывают менее выражены, чем в операционном или аутопсийном. Избежать аутолиза, позволяет быстрая фиксация материала.
12. В макропрепаратах кожи могут быть обнаружены нерастворимые экзогенные пигменты, используемые для нанесения татуировок. Эти депозиты обычно инертны по отношению к гистохимическим тестам и не дают анизотропии в поляризованном свете. Однако же весьма желательно описывать наличие татуировок в протоколе операции и при макроскопическом исследовании нефиксированного операционного материала – это поможет избежать немалых затрат времени и ресурсов на выяснение природы пигментации в случаях когда это имеет решающее диагностическое значение.
|
|
|
13. В ряде случаев используют цветное маркирование хирургического края удаленного образца для его правильной ориентации в макропрепарате или для заливки в блоке. Для маркировки обычно используются india ink, silver nitrat, alcian blue, alcian green и многие патентованные составы различных цветов, которые окрашивают поверхность образца и могут проникать в ткань на различную глубину.
14. Кроме диагностически значимой нагрузки, процедура макроскопического описания несет в себе и важные технологические элементы, призванные обеспечить доказательность диагностического заключения – это методически правильная вырезка и маркировка материала.
Общие рекомендации по процедуре вырезки
1. Проверка качества предварительной фиксации всегда рекомендуется производить перед началом работы с материалом. При этом следует выяснить качество фиксирующей жидкости и оценить соблюдение общих правил фиксации в части размера образцов, размеров контейнера и количества фиксирующей жидкости. В первую очередь, следует определить – какая жидкость залита в контейнер. Не редки случаи, когда вместо формалина в биопсийный контейнер заливаются другие жидкости, не пригодные для целей фиксации тканей. Во-вторых, следует помнить, что при фиксации образцов, содержащих большое количество жидкой крови или жировой ткани, фиксирующая жидкость быстро загрязняется посторонними примесями. В таких случаях фиксирующую жидкость следует сменить в течение нескольких часов после начала фиксации. Если доставка биопсийного материала в патолого-анатомическое отделение откладывается на более длительный срок – эту процедуру следует осуществить на месте взятия материала. Недостаточное внимание должной фиксации заведомо проблемных (крупных) образцов часто приводит к дефектам гистологической обработки тканей.
2. Недостаточно фиксированные образцы не следует запускать в дальнейшую проводку. Дефекты фиксации образцов обнаруживаются при вырезке, как правило, в глубине больших кусочков, и отличаются от поверхностных слоев ткани красноватым оттенком окраски. Плохо, если такие участки захватывают область интереса – именно в них могут проявиться дефекты дальнейшей гистологической обработки, а при микроскопическом исследовании нередко обнаруживаются аутолитические изменения тканей. Все отмеченные дефекты фиксации следует подробно описать в протоколе вырезки материала.
3. Из крупного образца вырезаются более мелкие кусочки, толщиной не более 3-4 мм. Это особенно важно для плотных тканей. Приготовление образцов толщиной более 6 мм может быть причиной некачественной проводки ткани. При вырезке следует помнить и то, что площадь кусочка в последующем может оказать влияние на толщину парафиновых срезов – зависимость здесь обратно пропорциональная. Идеальны для микротомии кусочки с площадкой среза, сторона которой не превышает 5-8 мм. Для парафиновой заливки с использованием стандартных заливочных форм следует вырезать кусочки трех типоразмеров сообразно размерам заливочных форм – до 5х5 мм, 10х10 мм, до 20х20 мм и до 20х30 мм. При значительных размерах зоны интереса следует помнить, что предельный размер кусочков при заливке в стандартные заливочные формы не может превышать 20 мм. В таких случаях можно для заливки вырезать несколько последовательно ориентированных кусочков, что позволит в дальнейшем реконструировать микроскопическую картину.
4. Форма вырезаемых образцов. Вырезку следует производить так, чтобы в итоге поверхность образца в области интереса, предназначенная для среза, была плоской и на ней должны быть представлены все слои ткани. Неровные образцы требуют значительной обрезки при микротомии, что может привести к потере части ткани образца и повышенному износу микротомных лезвий.
5. Количество вырезаемых образцов определяется клиническими рекомендациями, а в неопределенных случаях – соображениями диагностической целесообразности, определяемыми врачом-патологоанатомом.
6. При вырезке рекомендуется придерживаться правила: в одну кассету для проводки следует помещать только один тканевой образец, на одну кассету следует наносить только один уникальный регистрационный номер, соответствующий номеру тканевого образца.
7. Следует избегать повреждений тканей, в особенности не полностью профиксированных – не давить, использовать только острые лезвия, разрезы производить плавными движениями в один рез. Грубое обращение с образцами, использование тупых лезвий или ножниц приводят к деформациям и повреждениям ткани.
8. Каждый образец следует класть на чистую поверхность, чтобы исключить попадание мелких фрагментов тканей от другого образца. Поверхность, на которой производится вырезка, перед вырезкой каждого нового образца должна быть тщательно очищена влажной салфеткой. При вырезке на неочищенной поверхности возможен перенос частичек предыдущего образца на последующий образец. Особенно это важно в тех случаях, когда один за другим обрабатываются образцы одного типа. То же касается и инструментов, используемых при вырезке – всякий раз при переходе к вырезке нового образца инструменты следует тщательно очистить от остатков ткани предыдущего образца.
9. Свежие или не полностью зафиксированные ткани, а также толстоигольные биоптаты не следует зажимать между губчатыми гистологическими прокладками. Маленькие, свежие или не полностью зафиксированные образцы, помещенные на губчатые гистологические прокладки, могут быть повреждены в результате сдавления.
10. Для проводки ткани следует выбирать соответствующий тип кассет, чтобы избегать дополнительной деформации, сдавления или утраты образцов. Во время проводки фрагменты ткани сжимаются и могут продавливаться через слишком большие отверстия кассеты в растворы для проводки или в другую кассету. Не следует исходить из принципа «один размер кассет подходит для любых образцов».
11. Образцы в кассетах всегда следует размещать плоской поверхностью, предназначенной для среза, вниз. В последующем и при заливке образцы переносятся из кассет в заливочные формы этой же поверхностью вниз. Таким образом, поверхность, выбранная для среза врачом во время вырезки, всегда попадет на вершину парафинового блока.
12. Кассеты не следует переполнять образцами – таким образом, обеспечивается наилучший доступ реагентов и предотвращается искажение формы образца. Если образец слишком велик – необходимо использовать вторую кассету. Если в кассеты кладется слишком большое количество образцов – это затрудняет доступ реагентов и приводит к деформации кусочков.
13. Необходима четкая и разборчивая маркировка кассет, что важно для правильной идентификации образцов. Трудночитаемые номера недопустимы во избежание неоднозначного толкования маркировки. Если в лаборатории нет специального гистологического принтера для кассет, то для ручной маркировки следует использовать простой грифельный карандаш средней твердости, обеспечивающий легкое нанесение маркировки. Если при маркировке кассеты допущена ошибка – не следует стирать надпись ластиками, лучше всего ошибочную надпись соскоблить лезвием скальпеля. Маркировка кассеты должна быть максимально лаконична. Лучше всего ограничиться нанесением на кассету только индивидуального уникального номера тканевого образца (объекта). Любая избыточная маркировки затрудняет идентификацию надписи на последующих этапах гистологической обработки материала.
14. Часто при размещении мелких образцов в кассетах для проводки используются гистологические прокладки. Если образец недостаточно фиксирован и при закрывании кассеты плотно зажимается биопсийными прокладками, он деформируется с образованием треугольных и ромбовидных дефектов, повторяющих губчатую структуру материала прокладок. Для того чтобы избежать этого артефакта, следует запускать в проводку только полностью зафиксированные образцы такой толщины, чтобы при закрывании кассеты кусочек не сдавливался (не более 3-4 мм).
15. Достаточно распространена ситуация, когда образцы тканей для срочного исследования после приготовления замороженных срезов оттаивают в фиксаторе для последующей заливки в парафин. В таких случаях в образцах тканей могут обнаруживаться повреждения кристаллами льда или изменения, характерные для оттаивания. Например, в образце ткани, залитом в парафин после замораживания/оттаивания ядра часто бывают окружены светлой каймой цитоплазмы, хроматин менее конденсирован и интенсивно окрашен. Ядерные и цитоплазматические структуры хуже идентифицируются. Эти изменения необязательны, но вполне характерны. Особенно выражены низкотемпературные повреждения тканей при медленном замораживании – при этом тканевая жидкость кристаллизуется, а вокруг кристаллов льда формируются микроскопические трещины и разрывы. Для минимизации этих артефактов рекомендуется быстрое замораживание тканевых образцов при температуре не выше –200С, что позволяет тканевой жидкости застывать в аморфном состоянии, и использование специальных смесей для криомикротомов, способствующих равномерному охлаждению/замораживанию и медленному размораживанию кусочков в формалине. Но и при этом допускается только однократное замораживание/оттаивание образца, в противном случае качество гистологических препаратов будет прогрессивно снижаться прямо пропорционально числу циклов замораживания/оттаивания.
16. Попадание инородной ткани в исследуемый образец в большинстве случаев происходит при вырезке, например, когда нож или поверхность рабочего стола недостаточно очищаются после обработки предыдущего материала. Обработка скальпеля и рабочей поверхности водой или спиртовыми салфетками позволит избежать этого артефакта. Важно помнить, что расходные материалы (например, биопсийные кассеты, гистологические прокладки, растворы для проводки), при их многократном использовании тоже могут служить источником загрязнения препарата. При проводке материала, частички ткани могут задерживаться на кассетах или в многократно применяемых растворах. Для снижения риска загрязнения материала необходимо следить, чтобы биопсийные кассеты и полиуретановые прокладки использовались однократно. Следует также стремиться всегда использовать свежеприготовленные растворы. Загрязнение образца инородной тканью может произойти и на других стадиях обработки материала, например: при расправлении срезов в водяной бане после микротомии (флотация), если с поверхности воды не были удалены фрагменты срезов с предыдущего блока или если на поверхности воды одновременно расправляются срезы с нескольких блоков; в результате применения грязных пинцетов, заливочных форм, парафина; при окраске материала, если фрагменты срезов слетевших со стекла, попадают в красящий раствор, а потом оседают на другом препарате. В тех случаях, если возникают сомнения по поводу истинности наблюдаемых в образце изменений, необходимо провести повторное исследование, чтобы исключить возможность контаминации. Пренебрежение этим в ряде случаев, может стать причиной диагностических ошибок.
Общие рекомендации по маркировке объектов
Регистрационный номер является системообразующим параметром технологического процесса в любом патолого-анатомическом отделении, он должен быть уникальным и формироваться исходя из четкого алгоритма, ясного для всех работников патолого-анатомического отделения.
Следует использовать сквозную нумерацию случаев с добавлением количества объектов после косой черты:
0254783/1-9
Первая часть регистрационного номера (слева перед косой чертой) является основным идентификатором случая, вторая (после косой черты) отражает количество объектов в пределах данного случая.
При этом уникальные регистрационные номера отдельных объектов исследования на блоках и стеклах отображаются в следующем формате:
0254783-1
0254783-2
…………..
При данном формате регистрационного номера основной идентификатор всегда соответствует конкретной цифре, является неделимым, уникальным для данного случая и легко учитываемым. Такой формат регистрационного номера удобен при любых формах унифицированной ручной и, тем более, машинной обработке направлений (направление = номер). Основной идентификатор не зависит от количества вырезанных объектов. Особенно удобен в крупных патолого-анатомических отделениях, практикующих раздельную технологическую обработку различных типов биопсийного и операционного материала.
При данном формате регистрационного номера основной идентификатор всегда соответствует количеству обследованных пациентов, что при работе в системе ОМС соответствует записям в реестрах услуг. Перспективна при полном переходе здравоохранения на финансирование и взаиморасчеты по законченному случаю.
Сквозная нумерация в пределах определенного периода (год)
При данной системе регистрации для обеспечения уникальности регистрационного номера к основному идентификатору требуется добавление префикса (буква, цифра), указывающего на выбранный период. Ясно, что такой основной идентификатор никогда не является конкретной цифрой, а представляет собой некий набор букв и/или цифр, разделенных определенными знаками – такими как точка, черта-разделитель, тире и другими.
При любой выбранной стратегии следует стремиться к наиболее простому формату написания регистрационного номера без утраты его уникальности. Особенно это касается патолого-анатомических отделений, в которых используется ручное нанесение маркировки на блоки и микропрепараты – чем формат регистрационного номера проще, тем проще его наносить, и меньше вероятность возникновения ошибок при маркировке.
Поле для записи гистологической кассеты (рис. 18) имеет размер 25х5 мм. Современные гистологические принтеры для кассет позволяют разместить в этом поле до двух строк технологических записей до 11 знаков или полноценный штрих- или QR-код. При ручной маркировке возможно сделать запись в одну строку, содержащую не более 8-9 знаков.
Поле для записи предметного стекла (рис. 19) имеет размер 24х20 мм. Современные гистологические принтеры для кассет позволяют разместить в этом поле до четырех строк технологических записей до 11 знаков или полноценный штрих- или QR-код. При ручной маркировке возможно сделать запись в две строки, не более 6 знаков в каждой. Потому вопрос максимального упрощения формата регистрационного номера является важнейшей технологической задачей в патолого-анатомическом отделении.
Дополнительные идентификаторы
Дополнительные идентификаторы можно использовать для маркировки различных второстепенных признаков – таких как тип биологического материала, направившее учреждение, метод окраски и прочие параметры, удобные и принятые при организации технологического процесса в данном патолого-анатомическом отделении.
В качестве дополнительных идентификаторов можно использовать цветные заливочные кассеты (рис. 18), предметные стекла с цветным полем для записи (рис. 20), штрих-кодирование (рис. 21, 22) и прочие метки.
Основные требования
1. Регистрация биологического материала, поступившего в патолого-анатомическое отделение, производится в специальном регистрационном журнале по форме № 014-2/у.
2. Уникальный регистрационный номер проставляется на направлении одновременно с записью в регистрационном журнале.
3. Уникальный регистрационный номер проставляется на всех первичных материалах исследования – парафиновых блоках (заливочных кассетах при заливке) и микропрепаратах (предметных стеклах при микротомии).
4. Для нанесения регистрационного номера на заливочных кассетах и предметных стеклах используются простые графитовые карандаши или специальные гистологические принтеры с несмываемой краской.
5. Регистрационный номер на заливочных кассетах и предметных стеклах должен наноситься четко и ясно, без исправлений и помарок.
6. Регистрационный номер на предметном стекле должен четко соответствовать регистрационному номеру блока, с которого изготовлен данный микропрепарат.
Общие рекомендации по процедуре фиксации
1. Образец необходимо помещать в фиксирующий раствор немедленно после взятия. Важно, чтобы кусочки оставались незафиксированным максимально короткое время. Флаконы с материалом следует содержать при температуре не менее 4ºС. При отложенной фиксации дегенерация компонентов ткани начинается сразу после того, как ткань лишается кровоснабжения.
2. Соотношение объема фиксирующего агента и тканевого образца должно быть не менее, чем 20:1. Для этого необходимо правильно подбирать размер контейнера. При использовании контейнеров неадекватно малого размера возможно механическое повреждение, деформация и недостаточная фиксация образца (снижение объема фиксирующей жидкости меньше, чем 20:1).
3. Оптимальным для фиксации в текущей гистологической практике для решения большинства диагностических задач является раствор формалина, забуференный при рН 6,8-7,4[32]. Не рекомендуется использовать фиксирующие растворы с неустановленным рН. Кислый формалин приводит к образованию в ткани так называемого «формалинового пигмента» бурого цвета, вследствие взаимодействия с гемоглобином. При решении некоторых диагностических задач требуется приложение дополнительных усилий для идентификации химической природы этого пигмента, что может привести к существенному удорожанию исследования. В качественных гистологических препаратах формалинового пигмента быть не должно.
4. Для лабораторного приготовления забуференного формалина рекомендуется использовать пропись R. D. Lillie [5]. Но наиболее предпочтительно использование стандартизованных готовых растворов формалина для гистологии, выпускаемых многими производителями (Merсk, Sigma, Panreac, BioOptica и другие), в том числе и российскими (Синтакон, БиоВитрум, Блик и другие). Использование стандартизованных фиксирующих смесей позволяет стандартизовать процедуру и варьировать лишь время экспозиции в зависимости от особенностей исследуемых образцов. Кроме того, использование стандартизованных фиксирующих смесей позволяет избежать многих артефактов фиксации.
5. В ряде случаев для выполнения специальных диагностических или исследовательских задач требуется использование иных фиксирующих агентов, которых известно множество. При этом следует строго соблюдать протокол, предусмотренный оригинальной методикой, и помнить о том, что использование любых методов ускоренной фиксации, или методов фиксации, позволяющих исключить из дальнейшей гистологической обработки этапы щадящей дегидратации (безводные фиксаторы), чреваты появлением грубых тканевых артефактов. К специальным методам фиксации не следует прибегать без особой нужды, когда эта необходимость диктуется особыми диагностическими или исследовательскими задачами. Во всех случаях традиционной гистологии, паноптической гистохимии и иммуногистохимии рекомендуется использование стандартной фиксации материала 10% забуференным формалином.
6. Большие образцы тканей следует как можно быстрее доставлять в лабораторию для вырезки более мелких кусочков и обеспечения правильной фиксации. В крупных образцах, оставленных в фиксирующем растворе на длительное время до вырезки центральная часть остается незафиксированной и может подвергаться значительным разрушениям. Ускорить фиксацию крупных образцов тканей можно дополнительными разрезами толщиной не более 10 мм. Это обусловлено тем, что средняя скорость проникновения формалина в ткани равна 1 мм в час, и она замедляется по мере удаления от поверхности образца. Считается, что без ущерба для качества фиксации можно вырезать кусочки толщиной не более 5 мм.
7. При фиксации ткань уплотняется и деформируется. Особенно важно избегать деформации нежных столбиков ткани, полученных при пункционных биопсиях, а также любых малых и тонких объектов. Для предотвращения фиксационной деформации столбики ткани рекомендуется до погружения в фиксирующую жидкость разместить на полоске плотной тонкой бумаги, плохо впитывающей жидкость, такой как, например, калька. Излишки кальки можно обрезать на расстоянии 1.0-1.5 мм от края кусочка ткани, и в таком виде образец вместе с калькой погружается в фиксирующую жидкость. Подложка из кальки не позволяет кусочку деформироваться в процессе фиксации. Нефиксированный кусочек хорошо прилипает к бумажной подложке. Кусочек, даже на короткое время помещенный в фиксирующую жидкость, к бумажной подложке не прилипнет. Потому процедуру эту следует выполнять непосредственно после получения образца ткани, и очень быстро, чтобы кусочки оставались незафиксированным максимально короткое время.
8. Особенно важно не допускать механических повреждений пункционного образца при манипуляциях с ним – столбик ткани рекомендуется придерживать пинцетом только за самый край и только в одном и том же месте. Определенную трудность может представлять извлечение столбика ткани из канала пункционной иглы. Для наиболее бережного извлечения столбика ткани пункционную иглу следует полностью раскрыть, поместить мандрен с желобом, в котором находится образец, в каплю теплого физиологического раствора, расположенную на горизонтальной чистой поверхности, и осторожными движениями с помощью тонких препаровальных инструментов снять образец с иглы в каплю физиологического раствора. После этого столбик ткани легко может быть перемещен на бумажную подложку. Этот прием удобно также использовать и при необходимости точной пространственной ориентировки кусочка при некоторых специальных видах исследования.
9. Окончательная фиксация тканевых образцов должна быть полной и адекватной. Забуференный формалин является вполне оптимальной фиксирующей жидкостью, и превышение экспозиции в качественном и незагрязненном растворе на часы или даже сутки не оказывает негативного влияния на ткани. Излишнее стремление минимизировать время фиксации в формалине может привести к недостаточной фиксации тканевых образцов, вызвать появление дефектов при дальнейшей обработке материала.
10. В порядке оптимизации лабораторных работ можно рекомендовать уже на этапе вырезки разделять потоки разнородных материалов. При этом материал эндоскопических и пункционных биопсий, соскобов эндометрия, биопсий кожи и шейки матки, операционного материала и проч. запускается в обработку отдельными сериями. Для каждой из этих серий материала желательно подобрать оптимальные условия фиксации. Это не сложно, ибо при использовании стандартизованных растворов фиксатора приходится варьировать лишь размерами вырезаемых объектов и экспозицией, величина которой зависит от размеров кусочков и некоторых особенностей тканей (избыток жидкой крови, жира и проч.), но должна быть не меньше 24 часов и не больше 48 часов.
Дата добавления: 2019-02-22; просмотров: 309; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!