Этапы занятия и контроль их усвоения
Государственное образовательное учреждение
Высшего профессионального образования
Санкт-Петербургская государственная
Медицинская академия им. И.И.Мечникова
Белки и ферменты
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ДЛЯ СТУДЕНТОВ
К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ
Под редакцией проф. В.А. Дадали, доц. Р.Н. Павловой
Санкт-Петербург
2011
УДК 577.1(076.5)
Белки и ферменты. Учебно-методическое пособие для студентов к практическим занятиям по биологической химии. /Под редакцией проф. В.А. Дадали, доц. Р.Н. Павловой. Издание переработанное и дополненное.- СПб,
СПбГМА им. И.И.Мечникова, 2011. – 112 с.
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов лечебного и медико-профилактического факультетов медицинских ВУЗов, выполняющих практические занятия по курсу биологической химии. В пособии сформулирована цель и мотивация каждой темы, вопросы для самоподготовки, основная и дополнительная литература к каждой теме, этапы проведения занятия и методика проведения практической работы. После каждой темы приведены обучающие тесты с ответами. 25% занятий предложены в виде ситуационных задач, для решения которых студенты пользуются дополнительной литературой, предлагаемой на занятии.
Методическое пособие подготовлено коллективом кафедры биохимии С.-Пб. ГМА им. И.И.Мечникова :Астратенковой И.В., Агафоновой О.А., Антоновой Ж.В., Бейшибаевой Ч.Р., Головановой Н.Э., Джангуловой Н.Э., Зайцевой Н.К., Ивановой Л.В., Кулеба В.А., Макаровой М.Н., Павловой Р.Н., Смертиной М.Н., Соколовой Е.А. под редакцией проф. В.А.Дадали, доц. Р.Н.Павловой
|
|
|
Методическое пособие утверждено Ученым Советом Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова, протокол №2/10 от 27 сентября 2010 г.
ã Коллектив авторов 2011
Введение
К числу важных и актуальных проблем современной медицины относится разработка принципов диагностики и патогенетической терапии различных заболеваний, защиты организма от вредных воздействий внешней среды.
XXI век характеризуется появлением или увеличением тяжести так называемых болезней цивилизации – атеросклероза и других сердечно-сосудистых заболеваний (ИБС, инфаркт, инсульт) диабета, онкологии, иммунодефицитов, повышенной нервно-эмоциональной нагрузки и стрессов и т.д.. Усугубляется действие техногенных факторов, прежде всего многочисленных чужеродных веществ, электромагнитных и других полей, вибрации, повышенной радиации , других излучений и т.д.
|
|
|
Если в основе жизнедеятельности лежит совокупность специфических превращений веществ и энергии, то функциональные и структурные нарушения, развивающиеся в живой системе под влиянием повреждающих факторов, следует рассматривать прежде всего как результат взаимодействия последних с жизненно важными субстратами клеток и тканей, как следствие торможения, дезорганизации или прекращения внутриклеточных процессов обмена веществ и энергии,
Поэтому изучение биохимического механизма действия патогенных факторов является необходимым элементом исследований, создающих научную основу для разработки способов ранней лабораторной диагностики, рациональной патогенетической терапии и профилактики заболеваний, вызываемых этими факторами. Все эти задачи в той или иной мере всегда возникают в поле зрения гигиенического профиля.
Биохимические исследования проводятся в современной клинике в широком масштабе при постановке диагноза и выбора тактики лечения. Они играют фундаментальную роль в разработке новых методов лечения, разработке соответствующих лекарственных препаратов и создания природных рецептур лечебно-профилактического действия, а также разработке современных схем лечебного питания. Особое значение приобретает понимание функции основных метаболических систем, ферментных систем биотрансформации лекарственных препаратов и ксенобиотиков, антиоксидантных систем
|
|
|
Биохимические исследования проводятся при изучении условий труда человека в разнообразных условиях его производственной деятельности, поскольку с их помощью удается выявить ранние, скрытые признаки развития в организме патологического процесса, вызванного действием агентов, специфических для данного производства, конкретизировать причины патологических изменений и разработать на этой основе, учитывая результаты физиологических, гематологических и клинических исследований, рациональные мероприятия, гарантирующие в дальнейшем сохранение здоровья работников данного производства.
Одну из важных задач санитарно-гигиенических исследований составляет научное обоснование безопасности условий контакта человека с потенциально вредными для здоровья агентами. Установление предельно-допустимых концентраций (ПДК) токсических веществ в воздухе и воде, допустимого уровня шумового воздействия или максимальной безвредной дозы радиации часто является необходимым ответственным этапом работы.
|
|
|
Поскольку развитию функциональных изменений, характерных для патогенного фактора, предшествуют метаболические сдвиги, их выявление с помощью разнообразных биохимических методов в большой мере способствует успешному решению упомянутой задачи.
Непосредственно связана с биохимическими концепциями и методами и современная наука о рациональном питании здорового и больного человека. Качественная и количественная характеристика химического состава продуктов питания , данные о содержании в этих продуктах белков, углеводов, липидов, витаминов, минеральных веществ и других микронутриентов, их превращениях в организме при различных функциональных состояниях последнего и в различных условиях-
эти и другие вопросы подобного рода, специфичные для гигиены питания, решаются на биохимической основе.
Приведенные соображения предопределили тематический характер лабораторных работ, выполняемых на кафедре биологической химии студентами лечебного и медико-профилактического факультетов и были учтены авторами в настоящих методических указаниях.
Тема 1: Строение и свойства аминокислот. Методы исследования аминокислот.
Место проведения - кафедра биохимии. Продолжительность занятия - 180 мин.
2. Цель занятия: Систематизировать знания студентов о строении и свойствах аминокислот, необходимые для оценки физико-химических свойств и биологической роли белков. Обсудить различные методы исследования белков и идентификации аминокислот.
3. Конкретные задачи:
3.1. Студент должен знать
- классификацию и строение аминокислот
- физико-химические свойства аминокислот
- роль аминокислот в организме.
3.2. Студент должен уметь
- написать пептид
- использовать цветные реакции на белки в диагностической практике
- анализировать результаты хроматографического разделения
4. Мотивация: Знания и навыки, приобретенные на занятии необходимы для оценки результатов санитарно-гигиенических исследований и в клинико-ди-агностической практике врача.
5. Задание для самоподготовки: студенты должны изучить рекомендуемую ли-тературу, используя вопросы для самоподготовки
6. Основная литература
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998, С. – 27 - 43, 53 - 56, 74 - 77.
2. Учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биологической химии. СПб., 2005
Дополнительная литература
3. Биохимия. Учебник для ВУЗов. Под редакцией чл.- корр. РАН, проф. Е.С. Северина. М. Из-во ГЭОТАР-МЕД, 2003, с. 10-19.
4. Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993, т.1, с.21 - 41.
5. Кальман Я. Наглядная биохимия. М.: Мир, 2000, с. 64 - 68.
6. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М.: Медицина, 1983, с. 7 - 24.
7. Лабораторные методы исследования в клинике. Под ред. Меньшикова В.В., М.: Медицина
6. Вопросы для самоподготовки.
1. Какова роль аминокислот в организме?
2. Что такое заменимые и незаменимые аминокислоты. Приведите примеры.
3. Приведите примеры производных аминокислот и охарактеризуйте их роль.
4. На чем основана классификация аминокислот? Приведите примеры и напишите структурные формулы аминокислот; дайте характеристику функциональных групп аминокислот.
5. Напишите пептид, содержащий полярные и неполярные радикалы ами-нокислот.
6. Что такое радикал аминокислоты и какова его роль в формировании бел-ковой молекулы?
7. Приведите примеры биологически важных пептидов и охарактеризуйте
их роль в организме?
8. Какие физико-химические свойства присущи аминокислотам?
9. Какие методы используются для исследования пептидов и аминокислот? Приведите примеры различных типов гидролиза.
10. Какие методы используются для определения N и C – концевых амино-кислот ? В чем заключается их принцип?
11. Какие цветные реакции на белки относятся к универсальным и почему?
12. Какие цветные реакции на белки относят к специфическим и почему? Приведите примеры специфических реакций.
13. Каково значение использования цветных реакций в практике врача?
14. Какие виды хроматографии вам известны?
15. На чем основан метод распределительной бумажной хроматографии?
16.Что такое свидетели (маркеры) и для чего они применяются?
17.Что такое величина Rf?
18.С какой целью используют различные виды хроматографии?
Этапы занятия и контроль их усвоения
| N п\п | Этапы проведения занятия | Формы проведения | Время (мин.) |
| 7.1 | Постановка задачи. | Излагает преподаватель. | 5 |
| 7.2 | Разбор теоретического материала. | Опрос студентов. Студенты пишут на доске формулы ами-окислот и пептидов обсуждают свойства аминокислот. | 90 |
| 7.3 | Приобретение практических навыков Выполнение практической части занятия, оформление про-токолов работы и подписание протоколов преподавателем. | 70 | |
| 7.4 | Подведение итогов занятия. Задание на дом | Излагает преподаватель. | 5 |
Лабораторная работа № 1
Цветные реакции на белки.
Цель работы: используя цветные реакции на белки, обнаружить белок в растворе. Открыть функциональные группы исследуемых аминокислот. УИРС U на основании полученных данных сделать заключение об амино-кислотном составе и полноценности двух белков - яичного и желатины.
Проведение цветных реакций основано на образовании окрашенных соединений в результате взаимодействия того или иного реактива с опреде-ленными функциональными группами, входящими в состав молекулы белка.
Существует два типа цветных реакций:
1. Универсальные – биуретовая (характерна для всех белков и доказы-вает наличие пептидной связи) и нингидриновая (определяет наличие NH2 – группы в a - положении у аминокислот и белков):
2. Специфические реакции, характерные для отдельных аминокислот, содержащих специфические функциональные группы.
Универсальные реакции на белки.
Биуретовая реакция. В результате взаимодействия ионов двухва-лентной меди с пептидными связями в щелочной среде образуется комп-лексное соединение, окрашенное в красно-фиолетовый цвет. Название реак-ции обословлено тем, что биурет (продукт конденсации двух молекул моче-вины NH2-CO-NH-CO-NH2 в аналогичных условиях дает такой же комплекс.
пептидные связи в биуретовый
енольной форме комплекс
Проведение реакции: к 4-5 каплям раствора белка добавляют 5 капель 10% раствора NaOH и 1 каплю (избыток мешает чтению результатов реак-ции!) 1% раствора CuSO4. Так же проводят реакцию с желатиной.
Специфичность реакции: реакцию дают все соединения, содержащие в молекуле две и больше двух близко расположенных пептидных связей. Реакция характерна для всех белков (как полипептидов), но не специфична для них.
Реакция с нингидрином основана на его взаимодействии со свобод-ной аминогруппой.
Механизм реакции: нингидрин, являясь сильным окислителем, вызыва-ет отщепление аминогруппы с образованием свободного аммиака, СО2, аль-дегида и восстановленной формы нингидрина. Восстановленная форма нин-гидрина, реагируя с аммиаком и избытком нингидрина, дает продукт конден-сации фиолетового цвета.
 |
Проведение реакции: к 4-5 каплям раствора белка добавляют 5 капель раствора нингидрина и длительно (5-10 мин) нагревают на кипящей водяной бане. Присутствующий аммиак должен быть удален из системы. Аналогич-ным образом проводят реакцию с желатиной.
Специфичность реакции: в реакцию вступают белки, пептиды, свобод-ные аминокислоты и их производные, имеющие свободную амино группу в a -положении.
Специфические реакции на отдельные аминокислоты и аминокислоты, входящие в состав молекулы белка или полипептида
Ксантопротеиновая реакция происходит при условии наличия в молекуле белка радикалов циклических аминокислот.
Механизм реакции: при действии на белок концентрированной азотной кис-лоты (белок при этом выпадает в осадок U см. раздел «Денатурация белков») происходит нитрование циклических (содержащих бензольное кольцо) ради-калов аминокислот и образование нитропроизводных, окрашенных в желтый цвет. При подщелачивании окраска усиливается.
Молекула тирозина динитропроизводное хиноидное
в пептидной цепи тирозина производное тирозина
Проведение реакции: к 4-5 каплям раствора белка добавляют 2-3 капли концентрированной азотной кислоты. Образуется осадок белка, который при осторожном нагревании на водяной бане окрашивается в желтый цвет. К ох-лажденной (!) пробе добавляют избыток аммиака – появляется оранжевое ок-рашивание. Аналогичным образом проводят реакцию с желатиной.
Специфичность реакции: реакцию дают соединения, имеющие бен-зольные кольца в молекуле.
Реакция на аргинин (реакция Сакагучи) обусловлена образованием в щелочной среде ярко-красного продукта конденсации гуанидиновой груп-пировки с a - нафтолом.
+
аргинин a - нафтол
 |
+ NH3
 |
хиноидный аммиак
комплекс
Выделяющийcя при реакции аммиак разлагается гипобромитом:
2NH3+ 3NaBrO → N2+3H2O+3NaBr
Проведение реакции: к 4-5 каплям раствора белка добавляют равный объем 10% раствора NaOH и 3 капли спиртового раствора a - нафтола. После перемешивания добавляют 2-3 капли 2% раствора NaBrO. Появляется малиново-красное окрашивание. Так же проводят реакцию с желатиной.
Специфичность: реакция характерна для соединений, содержащих гуанидиновую группировку.
Реакция на слабосвязанную серу (реакция Фоля). При наличии в молекуле белка или пептида сульфгидрильных (тиоловых) групп SH ще-лочной гидролиз приводит к отщеплению серы в виде сульфида и при до-бавлении ионов Pb+2 к образованию черного осадка PbS.
1. + 2NaOH →
 |  | ||
+Na2S + H2O
2. (CH3COO)2Pb + 4 NaOH → Na2PbO2 + 2CH3COONa + 2 H2O
3. Na2S + Na2PbO2 + CH3СOOH PbS_ + CH3COONa
сульфид свинца
черного цвета
Если в реакцию включаются дисульфидные группы остатков цистеина, то они должны вначале подвергнуться восстановительному расщеплению.
Проведение реакции: при добавлении к нескольким каплям раствора ацетата свинца избытка 10% раствора гидроксида натрия образуется щелоч-ной раствор плюмбита натрия. К нему приливают несколько капель раствора белка. Смесь нагревают на кипящей водяной бане. Раствор окрашивается в темно бурый цвет. Так же проводят реакцию с желатиной.
Специфичность реакции: реакция характерна для соединений, содер-жащих тиоловые группы.
Результаты лабораторной работы
| Наименование Реакций | Субстрат | Окра- шива-ние | Чем обусловлена реакция |
| Биуретовая Нингидриновая Ксантопротеино-вая Реакция Фоля С a -нафтолом (Сакагучи) | а) яичный белок б) желатина а) б) а) б) а) б) а) б) |
Вывод:
Клинико – диагностическое значение цветных реакций.
1. Цветные реакции используют для диагностики заболеваний, при которых происходит
- наследственное нарушение метаболизма отдельных аминокислот (фенилкетонурия, гомоцистинурия – методы смотри ниже).
- усиленный распад тканевых белков (злокачественные новообразования, гипертиреоз, ожоги).
- нарушение реабсорбции аминокислот в почках.
2. С помощью цветных реакций можно оценить качественный и коли-чественный состав белков и пептидов в биологических жидкостях, а также полноценность белков в пищевых продуктах.
3. В санитарно-гигиенической практике цветные реакции используют для количественного и качественного определения белковых веществ (загрязне-ний) во внешней среде (атмосферном воздухе, сточных водах и т.д.).
Дата добавления: 2019-02-13; просмотров: 102; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!