Иммуно-FISH на стандартно-распластанных препаратах синаптонемных комплексов мыши.
В данном разделе представлены результаты FISH на препаратах, ранее исследованных методами иммуноокрашивания.
Для контрольных экспериментов мы использовали стандартный метод распластывания ядер сперматоцитов I порядка на гипотоническом растворе 0.2М сахарозе. Как и ожидалось, полученные спреды отличались стандартной степенью распластывания.
Осевые элементы хромосом и центромеры хорошо выявлялись в таких ядрах.
Оба ДНК-сателлита были обнаружены нами в околоцентромерных регионах хромосом. Причем, как и в случае препаратов метафазных хромосом, мажорный сателлит занимал значительно большую площадь, чем минорный, распространяясь практически на все зоны, которые соответствуют интенсивной окраске DAPI (Рисунок 11 слева и справа).
Рисунок 11. Иммуно-FISH на перпаратахстандартногораспластываниясинаптонемных комплексов мыши. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3), центромерных белков (centromere). Фиолетовый сигнал – минорный сателлит, зеленый сигнал – мажорный сателлит. Масштабный отрезок – 10 мкм.
Однако пересекающиеся осевые элементы хромосом и небольшие размеры стандартно-распластанных ядер не позволяли детально исследовать особенности структуры минорного и мажорного сателлитов для каждой хромосомы в отдельности. Поэтому мы исследовали тотальные препараты СК средней степени распластанности.
При проведении Иммуно-FISH с ДНК-зондами к сателлитной ДНК мыши на препаратах средней степени распластывания, мы получили изображения более вытянутых зон гетерохроматина (по DAPI-окраске), которые связывали некоторые негомологичные хромосомы (Рис. 12). Сигнал мажорного сателлита повторил контуры этих зон, соединяя центромерные зоны некоторых хромосом. Минорный сателлит, располагался более локально в околоцентромерной области, но также обнаружены «мостики» между центромерными регионами негомологичных хромосом (Рис. 12-13).
|
|
|
Рисунок 12. Иммуно-FISH на перпаратахстандартногораспластываниясинаптонемных комплексов мыши. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3), центромерных белков (centromere). Фиолетовый сигнал – минорный сателлит, зеленый сигнал – мажорный сателлит. Масштабный отрезок – 10 мкм.
Рисунок 13.Совмещение Иммуно-FISH для обоихсателлитных ДНК. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3). Фиолетовый сигнал – минорный сателлит, зеленый сигнал – мажорный сателлит. Масштабный отрезок – 10 мкм.
Иммуно-FISH на сверхраспластанных препаратах синаптонемных комплексов мыши
При проведении метода иммуно-FISH с ДНК-зондами на приготовленных нами сверхраспластанных препаратах синаптонемных комплексов мы решили важную проблему стандартной методики – избавились от пересекающихся и близкорасположенных хромосом (Рис. 14).
|
|
|
Рисунок 14. Иммуно-FISH для сателлитных ДНК мыши: мажорного и минорного. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3), центромерных белков (центромера). Фиолетовый сигнал – минорный сателлит, зеленый сигнал – мажорный сателлит. Масштабный отрезок – 10 мкм.
Исходя из полученных совмещенных изображений FISH-окрашивания обоихсателлитных ДНК и иммуноокрашивания на сверхраспластанных препаратах, мы можем сказать следующее:
1. Связующие «мостики» между негомологичными аутосомами, выявляемые с помощью интенсивной DAPI-окраски в значительной степени совпадают с сигналом мажорного ДНК-сателлита (Рис. 14).
2. Минорный сателлит занимает значительно меньшую площадь, но также локализуется в описанных выше «мостиках».
3. Количество «связанных мостиками» хромосом совпадает для всех типов приготовления препаратов.
4. Значительно более высокая компактность минорного сателлита выявляется для всех типов исследованных нами препаратов.
Заключение
Проведено сравнительное исследование воздействия различных гипотонических растворов при приготовлении препаратов распластанных ядер клеток, а также выбран оптимальный способ фиксации препаратов.
|
|
|
При помощи разработанного метода сверхраспластываниямейотических хромосом визуализирован СК-кариотип самца мыши Musmusculus с детализацией, ранее доступной только для метода электронной микроскопии.
Представлены детальные изображения тотальных препаратов синаптонемных комплексов и отдельных хромосом. Проведено иммуноокрашивание структурных белков осевых элементов хромосом, белков репарации двунитевых разрывов ДНК и маркера инактивированного хроматина на сверхраспластанныхаутосомах и половых хромосомах. Исследована структура двух ДНК-сателлитов мыши на препаратах разной степени распластывания СК. Выявлена сеть тяжей хроматина, объединяющая негомологичные хромосомы в единую систему,по-видимому обеспечивающую динамичную стабильность хромосомных территорий.
ВЫВОДЫ
Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 493; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!