Иммуноокрашивание белковых маркеров мейоза на сверхраспластанныхпрепаратах СК



В ходе иммуноокрашиваниясверхраспластанных препаратов мы выяснили, что основные белковые маркеры: структурные белки осевых элементов хромосом, центромерные белки, белки репарации ДНК и маркеры инактивации хроматина успешно выявляются в структуре сверхраспластанных СК.

На рисунке 6 продемонстрированы фрагменты препаратов синаптонемных комплексов с детализацией синапсиса (или десинапсиса) аутосомных хромосом. Выявляется твистинг (перекручивание осевых элементов), прителомерныйсинапсис.

 

 

Рисунок 6.Сверхраспластанный препарат синаптонемных комплексов мыши. Особенности синапсиса и десинапсиса гомологичных хромосом мыши. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3) Масштабный отрезок 10мкм.

 

На рисунке 7 представлен сверхраспластанный половой бивалент мыши. Иммуноокрашивание белка GammaH2AX (зеленый сигнал) подтверждает, что данная пара хромосом – половой бивалент. Осевые элементы X- и Y-хромосом имеют в некоторых участках раздвоенную структуру, что является демонстрацией наличия двух сестринских хроматид в каждой из половых хромосом (Рис. 5). Такая детализация обычно недоступна на препаратах для световой микроскопии. Особенности синапсиса чаще исследуют с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Таким образом мы показали применимость иммуноокрашивания модифицированных гистонов (GammaH2AX) на сверхраспластанных препаратах хромосом.

 

 

 

Рисунок 7.Сверхраспластанный половой бивалент мыши. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3), инактивированного хроматина (GammaH2AX).

 

На рисунке 8представлено иммуноокрашивание белков центромеры (антителами АСА) – слева и белка RAD51 – маркера незавершенной репарации двунитевых разрывов. Таким образом, при работе с препаратами сверхраспластанных СК методы иммуноокрашивания остаются применимы. Более того, благодаря большей детализации на полученных нами изображениях, в будущем возможно исследование структуры СК, которое ранее проводилось только с помощью электронной микроскопии на распластанных препаратах ядер. 

 

Рисунок 8.Сверхраспластанный препарат синаптонемных комплексов мыши. Иммуноокрашивание осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3), центромерных белков (centromere) и маркера репарации DSBs (RAD51). Масштабные отрезки - 10мкм.

 

 

4. Флуоресцентная insitu гибридизация (FISH) с зондами к минорному и мажорному ДНК-сателлитам мыши

 

Для контрольных экспериментов, с целью проверки наших олигонуклеотидных ДНК-зондов, мы использовали препараты, приготовленные из следующих типов клеток:

1. интерфазных ядер клеток мыши (культура фибробластов)

2. метафазных ядер клеток мыши (культура фибробластов)

1. На стадии интерфазы мы регистрировали частичную кластеризацию сигналов мажорного и минорного сателлитов, что согласуется с данными о их взаиморасположении в перицентромерном и прицентромерномгетерохроматине хромосом мыши (Рис. 9). 

 

Рисунок 9. Распределение минорного и мажорного сателлитов на препарате ядра клетки на стадии интерфазы. Фиолетовый сигнал – минорный сателлит, зеленый сигнал – мажорный сателлит. Масштабный отрезок – 10 мкм.

 

2. Стадия метафазы митотического деления является наиболее часто используемой стадией жизненного цикла клетки для локализации последовательностей методом FISH. В нашей работе мы также сделали контрольные опыты по insitu гибридизации на метафазных пластинках мыши с ДНК-зондами к минорному (желтый сигнал) и мажорному (красный сигнал) сателлитным повторам (Рисунок 10)

 

 

Рисунок 10. Распределение минорного и мажорного сателлитов на препарате метафазной пластинки мыши, на стадии метафазы митотического деления клетки из культуры фибробластов. Фиолетовый сигнал – минорный сателлит, зеленый сигнал – мажорный сателлит. Масштабный отрезок – 10 мкм.

 


Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 564; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:






Мы поможем в написании ваших работ!