Разработка метода сверхраспластывания ядер сперматоцитов I порядка
В основе метода распластывания (приготовления спредов) ядер, находящихся на стадии профазы I мейоза, лежит сочетание воздействия на клетки гипотоничсеским раствором и сил поверхностного натяжения при слиянии капель.Мы провели сравнение нескольких типов воздействий на суспензию клеток при приготовлении препаратов. Условно, проверенные нами воздействия можно разделить на две группы:
- Подбор раствора, с каплями которого сливаются капли суспензии клеток;
- Манипуляции с процессом слияния капель раствора и суспензии.
Оценка результатов проводилась после имуноокрашивания препаратов антителами к белку осевых элементов хромосом в мейозе (SYCP3).
Для обобщения результатов проведенной работы была составлена Таблица 1, где первая группа воздействий выделена зеленым, вторая – голубым цветом.
Критериями оценки результата служили: степень распластывания, фрагментация осей хромосом, сохранность архитектуры ядра и чистота препарата (отсутствие фрагментов клеток).
Способ распластывания | Степень распластывания | Фрагментация осей хромосом | Сохранность архитектуры ядра | Чистота препарата | |
1 | Наслаивание на капли 0.2М сахарозы | 2 | 1 | 3 | 3 |
2 | Наслаивание на капли 0.2М сахарозы с Tween 20 | 2 | 1 | 2 | 1 |
3 | Наслаивание на дистиллированную воду | 3 | 3 | 1 | 2 |
4 | Слияние двух капель | 2 | 1 | 3 | 3 |
5 | Последовательное слияние капель | 3 | 2 | 2 | 1 |
6 | «Протягивание» суспензии между стеклами | 3 | 2 | 2 | 3 |
7 | Варианты 5 + 6 | 3 | 2 | 2 | 3 |
|
|
1- слабое 2 – среднее 3- сильное
Первый вариант распластывания клеток на каплях 0.2М сахарозы считается классическим методом Navarro с соавторами (Navarroetal., 1981). Поэтому результаты наших модификаций метода были сопоставлены с препаратами, полученными на 0.2М сахарозе (первая строка).
Для усиления действия сил поверхностного натяжения капли использовалась гидрофобная поверхность (тефлон или графитовая бумага), с которой капля суспензии переносилась на стекло. Были испробованы различные модификации: подвешенная капля, метод, когда капля с суспензией сливается с окружающими её каплями дистиллята, использование детергента (tween 20). Однако наибольшую эффективность показала группа методов, в которых капли последовательно сливали и затем.результирующая капля с помощью фильтровальной бумаги протягивалась между покровным и предметным стёклами.
В результате проведенной работы по сравнению изображений сверхраспластанных ядер сперматоцитов мы пришли к двум выводам:
1. Оптимальный гипотонический агент для сверхраспластывания – дистиллированная вода;
|
|
2. Оптимальный способ распластывания - сочетание слияния капель и «протягивание» суспензии между предметным и покровным стеклом.
С помощью модифицированного нами метода распластывания ядер сперматоцитов, мы получили препараты и подвергли их иммуноокрашиванию.
В 30% случаев на полученных нами препаратах обнаруживались ядра средней степени распластывания. Диаметр таких распластанных ядер составляет 45-80 мкм. На Рисунке 4 представлено такое ядро. Половой бивалент иммуноокрашен антителами к модифицированной форме гистона GammaH2AX – маркеру инактивированного хроматина. Детализация полученного изображения значительно лучше, чем при стандартном распластывании. Фрагментации осевых структур не наблюдается. Архитектура распластанного ядра, в целом сохранена.
Рисунок 4. Распластанное ядро сперматоцита I на стадии пахитены. Иммуноокрашивание осевых элементов (SYCP3) и маркера инактивированного хроматина(Gamma H2AX). Хроматин окрашен красителем DAPI.
Большая часть (около 70%) ядер на полученных нами препаратах имели уже значительную степень распластанности хроматина. Такие распластанные ядра зачастую выходили за границы поля зрения 40х объектива (CarlZeiss EC PLAN-Neophluar). Некоторые тотальные препараты СК требовали 3-4 снимка для покрытия всего ядра. Диаметр таких распластанных ядер составлял 80-250 мкм и более. На рисунке 3 представлен тотальный сверхраспластанный препарат синаптонемных комплексов мыши, диаметр распластаного хроматина около 200 мкм. Для сравнения в том же масштабе представлены: метафазная пластинка (метафаза митоза) и обычный распластанный препарат синаптонемных комплексов из Рисунка 3. Исходя из общей картины на рисунке 5 можно сделать вывод, что, не смотря на частичнуюфрагментированность осевых элементов, общая архитектура распластанного ядра сохраняется. Половой бивалент имеет характерную структуру и легко выявляется даже без иммуноокрашивания.
|
|
Рисунок 5. Сверхраспластанное ядро сперматоцита I на стадии ранней диплотены. Иммуноокрашивание осевых элементов (SYCP3). Хроматин окрашен красителем DAPI.Для сравнения представлены: метафазная пластинка и классический препарат СК в том же масштабе.
Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 640; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!