Получение суспензии сперматоцитов.

Musmusculus

Выполнили ученики 10 и 11 классов:

Лосев Михаил Игоревич

Вольхин Илья Александрович

Научный руководитель:

к.б.н., н.с. лаборатории цитогенетики

ИОГен им. Н.И. ВавиловаРАН

В.Е. Спангенберг

Москва – 2018

Введение

Сателлитная ДНК – характерный компонент геномов всех эукариот. Современные методы секвенирования имеют ряд ограничений при сборке и анализе больших массивов тандемно расположенных повторяющихся элементов ДНК. Таким образом, важная информация о размере и структуре огромных массивов ДНК в составе хромосом остается неизученной у многих объектов.

Для исследования сателлитной ДНК обычно используют цитогенетические методы на препаратах митотических метафазных хромосом. Для более детального исследования применимы препараты распластанных хромосом на стадии профазы I мейоза, а точнее пахитенных бивалентов (синаптированных гомологичных хромосом). Линейные размеры хромосом в пахитене мейоза больше чем в метафазе митоза. Такие препараты активно используются для изучения структуры отдельных хромосом с помощью оптической флуоресцентной микроскопии. Но световые микроскопы имеют известные ограничения, связанные с физическими свойствами видимой части спектра. Поэтому исследования ультраструктуры клеток часто проводят с помощью электронной микроскопии. Однако приготовление препаратов для электронной микроскопии сопряжено с необратимыми изменениями белков и ДНК, часть методов иммуноокрашивания значительно усложняется или невозможна.

 Структура хромосом в мейозе отличается удивительной пластичностью. Оси хромосом в течение профазы I деления способны изменять длину более чем в два раза. Именно этот факт послужил идеей для разработки нашего метода сверхраспластывания. В нашей работе мы решили модифицировать метод распластывания ядер сперматоцитов мыши.

Таким образом, используя сильные стороны световой флуоресцентной микроскопии, в сочетании с новым методом приготовления препаратов, мы предприняли попытку увеличить детализацию в цитогенетических исследованиях.

Цели и задачи

Цель:

Разработать метод сверхраспластывания хромосом и исследовать белковые маркеры мейоза и ДНК сателлиты MusmusculusLinnaeus, 1758.

Задачи:

1. Освоение метода распластывания ядер мейотических клеток.

2. Модификация метода для получения сверхраспластыванных хромосом.

3. Иммуноокрашиваниемейоз-специфичных белков.

4. Проведение флуоресцентной insitu гибридизации с зондами к сателлитной ДНК.

5. Совмещение изображений иммуноокрашивания и FISH.

6. Анализ полученных результатов.

Обзор литературы

I Мейоз

Мейоз – клеточное деление, лежащее в основе полового процесса у эукариот. Формирование гаплоидных гамет из диплоидных клеток зародышевого пути осуществляется посредством двух мейотических делений, следующих за одним раундом репликации ДНК. Во время первого мейотического деления к полюсам расходятся гомологичные хромосомы (гомологи). Первое мейотическое деление называется редукционным делением, так как в результате деления сперматоцитов I порядка осуществляется редукция числа хромосом - гомологи расходятся в разные ядра и число хромосом в сперматоцитах II порядка становится равным 1n. Во втором делении мейоза к полюсам расходятся сестринские хроматиды (рис.1).

Рисунок 1. Схема двух последовательных делений мейоза с указанием плоидности.

Мейоз состоит из двух делений. Первое - редукционное, в нем расходятся гомологичные хромосомы. Профаза I состоит из 5 стадий:

1. Лептотена (лепнонема) - на этой стадии различимы хромосомы как очень тонкие нити за счет хромосомных осей, состоящих из белков когезинов . В следствие массивного насыщения белками, хромосомные оси в хромосомах становятся видны с помощью электронного микроскопа. Степень их компактизации меньше, чем в профазе митоза. В ранней лептотене, под действием специфических эндонуклеаз (в основном Spo11), возникают множественные двунитевые разрывы молекул ДНК (double-strandbreaks, DSBs). В то же время происходит взаимное узнавание отдельных локусов гомологичных хромосом и их попарное соединение, необходимое для дальнейшего прохождения кроссинговера (рекомбинации). Так же в лептотене происходит изменение расположения хромосом, характерного для соматических клеток. Начиная с премейотической интерфазы наблюдается эффект (фигура) Рабля - кластрирование (объединение) центромерных районов хромосом вблизи полюса клеточного деления, которая начиная с премейотической интерфазы и на протяжении всей лептотены, меняется на кластрированиетеломер хромосом на внутренней поверхности ядерной мембраны. Затем теломеры двигаются по мембране и к началу зиготены временно собираются на центросомном полюсе ядра, формируя структуру "букета". Внутри "букета" гомологичные хромосомы, фиксированные обоими концами на ядерной мембране, выстраиваются параллельно и выравниваются. Присоединение СК к мембране происходит с помощью пластинки прикрепления, состоящей из теломерный повторов, теломерных белков, субъединиц когезина и белков латеральных элементов. А передвижение теломер по мембране происходит за счет компонентов цитоскелета, которые связаны с теломерными концами хромосом с помощью трансмембранных белков. Между гомологичными хромосомами возникают контакты с помощью нитей хроматина, которые, вероятно, содержат сайты свежевозникшихDSBs. Малая часть лептотенных контактов превращается в контакты, названные ассоциациями осевых элементов (АОЭ).
2. Зиготена (зигонема) - на этом этапе происходит конъюгация гомологичных хромосом, за счет того, что АОЭ превращаются в точки инициации формирования синаптонемных комплексов, осевые элементы гомологичных хромосом, соединившись попарно, превращаются в два латеральных элемента синаптонемного комплекса (СК), именно в это время в состав осевых элементов инкорпорируются мажорные белки латеральных элементов СК, в результате чего образуются т. н. биваленты. Хроматиды связываются друг с другом с помощью специальной белковой структуры – синаптонемного комплекса (рис. 2,3)
3. Пахитена (пахинема) – Пахитена начинается с того момента, как полностью достроится СК. На этом этапе происходит процесс кроссинговера (обмена гомологичными участками хромосом, образование кроссоверных продуктов), который контролируется специальной группой генов, а так же для его прохождения необходимы белки MLH1 и MLH3 (белки мисматч репарации), которые стабилизируют нестабильную D-петлю и в следствии этого происходит захват второго конца двунитевого разрыва с образованием двойного Холидеевского перекреста, который осуществляют RecA-подобные белки ферменты Rad51 и Dmc1. Продукты этих генов образуют комплекс белков, катализирующих заключительные этапы рекомбинации. Появляются хиазмы – перекресты между хроматидами гомологичных хромосом. Во время пахитены происходит репаративный синтез ДНК.
4. Диплотена (диплонема) - на этой стадии происходит частичное отделение гомологичных хромосом друг от друга, однако на этой стадии ещё имеются хиазмы. На стадии диплотены происходит частичнаядеконденсация хромосом.
5. Диакинез - в ходе диакинеза хиазмы постепенно исчезают, хромосомы окончательно конденсируются, исчезают ядрышки, центриоли расходятся к полюсам клетки, и, наконец, исчезает ядерная оболочка. Но в отличие от митоза гомологичные хромосомы остаются связанными между собой, а не расходятся произвольным образом.

Метафаза 1 - бивалентные хромосомы выстраиваются вдоль экватора клетки, происходит это за счет когезии, а также за счет хиазм и униполярностикинетохоров, обусловленной тем, что в мейозе 1 не происходит гидролиза когезинов соединяющих центромерные районы сестринских хроматид, так как от гидролиза они защищены специфическим для I деления мейоза белком шугошином.

Анафаза 1 - микротрубочки сокращаются, биваленты делятся, и хромосомы расходятся к полюсам (основное отличие редукционного деления от эквационного).

Телофаза 1 - хромосомы деспирализуются и появляется ядерная оболочка.

Цитокинез 1 - деление тела клетки, в результате образуются две 2n клетки.

Между делениями мейоза идет интеркинез, то есть упрощенная интерфаза (без S фазы). Во время нее хромосомы частично деконденсируются, а потом конденсируются вновь.

2. Второе деление - эквационное - подобно митотическому, в нем расходятся сестринские хроматиды, и оно тоже делится на 5 стадий:

Профаза 2 - происходит конденсация хромосом, клеточный центр делится и продукты его деления расходятся к полюсам ядра, разрушается ядерная оболочка, образуется веретено деления, перпендикулярное первому веретену.

Метафаза 2 - двухроматидные хромосомы располагаются на «экваторе» (на равном расстоянии от «полюсов» ядра) в одной плоскости, образуя так называемую метафазную пластинку.

Анафаза 2 - двухроматидные хромосомы делятся и хроматиды расходятся к полюсам.

Телофаза 2- хромосомы деспирализуются и образуется ядерная оболочка.

Цитокинез 2 - деление тела клетки, в результате из каждой 2n получается по 2 1n.

Интервал между первым и вторым делением мейоза иногда очень велик. Например, у яйцеклеток человека (точнее, у их предшественников) первое деление мейоза начинается ещё в ходе внутриутробного развития и останавливается на стадии зиготены. После наступления половой зрелости, в процессе овуляции, т. е. при выходе ооцита из яичника, оно заканчивается, и начинается второе деление мейоза, причем оно останавливается на метафазе II и заканчивается только после оплодотворения. В результате из одной диплоидной клетки образуется четыре гаплоидных клетки.

II Синаптонемный комплекс

Синаптонемный комплекс был открыт в 1956 году одновременно и независимо друг от друга двумя американскими исследователями МонтрозеМозесом и Дон Фасетом. Открытия СК стало революционным событием в исследовании мейоза, которое поставило десятки новых вопросов, которые решаются сегодня в лабораториях всего мира.

Рисунок 2. Строение синаптонемного комплекса ( по Page&Hawley, 2004)

Синаптонемный комплекс – субмикроскопическая нуклеопротеидная структура, образующаяся между гомологичными хромосомами в профазе I мейоза, и обеспечивающая кроссинговер. Образование синаптонемного комплекса начинается на стадии лептотены и полностью завершается на стадии пахитены. На стадиях диплотены и диакинеза белковые структуры разрушаются. В пахитене одновременно начинают идти два параллельных процесса: синапсис и рекомбинация.

Кариотипирование на основе СК имеет то преимущество перед кариотипированием метафазных хромосом, т.к. профазныемейотические хромосомы (и СК, соответственно) длиннее метафазных хромосом соматических клеток.

III Сателлитная ДНК

Сателлитные ДНК – тандемно повторённые нуклеотидные последовательности. В геномах эукариот они занимают до 10% ДНК. Предположительно играют роль в пространственной организации хроматина: формирование теломер, центромер, организации хромосомных территорий. Всего на настоящий момент обнаружены десятки различных сателлитов ДНК Musmusculus. Два самых крупных сателлита, мажорный (Ма) и минорный (Ми), расположены в прицентромерномгетерохроматине и являются АТ-богатыми участками (Комиссаров, 2012). Наибольший размер мономера имеет мажорный сателлит – 234 п.н., а второй по величие - мономер минорного сателлита – 120 п.н.

Предыдущие исследования минорного сателлита мыши показали, что в пахитене обнаруживается четкие гибридизационные сигналы, локализованные в прицентромерных областях хромосом. Окрашивание распластанных мейотических и митотических ядер хорошо иллюстрирует, что минорный ДНК-сателлит располагается в хроматине компактно. На стадии пахитены на мейотических хромосомах гибридизационные сигналы выявляются на одном из концов всех аутосом и Х хромосомы. По величине этот сигнал может незначительно превышать ширину СК. При этом на СК-биваленте на одном из концов СК иногда видны сразу два расположенных рядом точечных сигнала. Это соответствует прицентромерным областям для каждой хромосомы в акроцентрическом биваленте мыши. Было установлено, что только прицентромерный район Y-хромосомы не гибридизуется с зондом к минорному ДНК-сателлиту. Псевдоаутосомный район располагается на противоположном от центромеры конце Х-хромосомы. Это район синапсисаХ- и У-хромосом. На короткой У-хромосоме сигнал минорногоДНК-сателлита не выявлен (Спангенберг 2013).

Материалы и методы

Получение суспензии сперматоцитов.

Семенники мыши помещали в чашку Петри со средой Игла без глутамина. Удаляли тунику, жировую ткань и крупные кровеносные сосуды. Семенные канальцы мыши переносили в стекло с лункой, в которую заранее вносили среду Игла. Ткань гомогенизировали с помощью автоматической пипетки (1000 мкл) в течение 15 минут. Под световым микроскопом оценивали степень гомогенизации суспензии. Полученную суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку и доливали среду Игла до отметки 5 мл (на 1 семенник мыши), центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали в 0,5-1 мл свежей среды Игла. Пробирку с суспензией клеток держали на льду.

Мы поможем в написании ваших работ!