Получение тотальных препаратов стандартно-распластанных синаптонемных комплексов (СК) на тефлоне.



Поверхность тефлоновой пластинки обезжиривали 70% этанолом. На обезжиренную поверхность наносили 6-9 капель (по 6 мкл) 0,2 М раствор сахарозы, поверх которых наслаивали по одной капле (по 2 мкл) полученной суспензии. Через 2 минуты поверхности капель касались стеклом, покрытым поли-L-лизином. Капли равномерно распределяли наконечником пипетки на первой трети поверхности предметного стекла. Для максимального использования материала остатки капель с тефлона собирали и переносили на новое стекло, покрытое L-полилизином. Так же, как и в случае с первым стеклом, капли равномерно распределяли наконечником пипетки на первой трети поверхности предметного стекла. В течение 10 минут суспензию клеток на стекле высушивали в горизонтальном положении. Подсушенные препараты фиксировали охлаждѐнным раствором 4% параформальдегида в 0,1 М растворе сахарозы в течение 10 минут. Фиксированные препараты отмывали в трѐх сменах 0,4% раствора Fotoflo (по 30 секунд в каждой смене) и сушили на воздухе. Готовые препараты хранили в холодильнике при -20°С.

Препараты метафазных митотических хромосом.

Препараты метафазных митотических хромосом получали стандартным методом с помощью метанол-уксусной фиксации (Рубцов, 2006).

Процедура иммуноокрашивания препаратов.

На препараты распластанных хромосом наносили первичные антитела (по 8 мкл каждого). Первыми наносили антитела, окрашивающие более мелкие структуры клеток. Стекла помещали во влажную камеру, переносили в холодильник, и инкубировали препараты с первичными антителами в течение ночи при -4°С. Перед нанесением вторичных антител стекла промывали в трѐх сменах PBS (0,01М, рН 7,3-7,5, 0,137 моль/л NaCl, 0,0027 моль/л KCl) (БиолоТ) по 5 минут. Далее на препараты наносили вторичные антитела (по 8 мкл каждого) и инкубировали препараты во влажной камере в течение двух часов при 37°С. После инкубации со вторичными антителами препараты промывали 3 раза по 5 минут в PBS. Далее наносили каплю среды для заключения препаратов Vectashield с красителем DAPI (VectorLaboratories), сверху препарат накрывали покровным стеклом.

 

5. Флуоресцентная insitu гибридизация (FISH) с зондами к сателлитной ДНК мыши.

В качестве ДНК-зондов для семейств повторяющихся последовательностей использовали искусственно синтезированные олигонуклеотиды (длиной в 24 и 30 нуклеотида), меченные флюорохромом FAM или TAMRA на 5' конце, синтезированные фирмой «Синтол» (Россия). ДНК-зонды:

Мажорный сателлит мыши - 5' TTCACGTCCTAAAGTGTGTATTT

Минорный сателлит мыши - 5' GAACAGATTAGATGAGTGAGTTACACTGAA

Препарат с нанесѐнной реакционной смесью накрывали покровным стеклом, края покровного стекла герметизировали с помощью резинового клея, чтобы избежать испарения и изменения концентрации компонентов реакционной смеси. Полученный препарат помещали в автоматичекийгибридайзерThermoBriteStatSpin S500. Денатурацию проводили при 73°С, в течение 3 минут. Отжиг проводили при 37°С в течение 12 часов. Препараты подвергались отмывке в 2Х SSC растворе в течение 5 минуты при температуре 50°С. Затем препарат промывали в дистиллированной воде в течение 20 секунд. На высохший препарат наносили каплю среды для заключения Vectashield с красителем DAPI (Vectorlaboratories) и накрывали покровным стеклом.

Флуоресцентная микроскопия.

Препараты анализировали с помощью универсального флуоресцентного микроскопа AxioImager D1 (CarlZeiss, Германия), оборудованного объективами PLAN-NEOFLUAR (при использовании 100×), ртутной лампой НВО, черно-белой CCD камерой накопления сигнала AxioCamHRm Rev.3 (CarlZeiss, Германия), набором комбинированных фильтров для флуорохромов, имеющего выход на компьютер. Компьютер снабжен программным комплектом AxiovisionRelease 4.6.3 (CarlZeiss, Германия) для получения видеоизображения.

Результаты

 

Стандатный метод распластывания ядер сперматоцитов I

 

Нами был использован стандартный метод распластывания ядер сперматоцитов I, используемый в лаборатории цитогенетики ИОГен РАН. Полученные препараты подходят для иммуноокрашивания антителами к основным маркерам рекомбинации, репарации ДНК, белкам инактивации хроматина. Для получения классических изображений распластанных ядер мы провели иммуноокрашивание антителами SCP3 (осевые элементы хромосом в мейозе), Rad51 (маркер репарации двунитевых разрывов ДНК).

Рисунок 3. Распластанное ядро сперматоцита I на стадии пахитены. Иммуноокрашивание осевых элементов (SYCP3) и белка репарации DSBs (RAD51). Хроматин окрашен красителем DAPI.

 

На Рисунке 3 отчетливо виден более интенсивно-окрашенный хроматин (светло-голубые пятна), составляющий прицентромерныйгетерохроматин и хромоцентры. Аутосомные хромосомы синаптированы, образуют биваленты, осевые структуры которых представлены красным цветом. Половые хромосомы X и Y синаптированы только частично в небольшом участке (ПАР-псевдоаутосомный регион) и имеют на осях фокусы белка RAD51 – маркера незавершенной репарации двунитевых разрывов (DSBs). Репарация DSBs в половом биваленте затягивается, поскольку полныйсинапсис X и Y не происходит из-за неполной гомологии между этими хромосомами. 

Таким образом, мы получили классический тотальный препарат синаптонемных комплексов (СК) с иммуноокрашиванием структурного белка (SYCP3) и маркера незавершенной репарации (RAD51). Степень распластывания достаточна для основных задач: СК-кариотипирование, исследования аномалий синапсиса хромосом. По границам хроматина, окрашенного красителем DAPI, диаметр распластанного ядра составляет 35-45 мкм.

Одной из основных задач нашей работы было получение сверхраспластанных хромосом. Поэтому после отработки базового метода мы провели ряд экспериментов по модификации условий распластывания ядер сперматоцитов.

 


Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 139; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ